Кратко о механизме
- Конфигурация хроматина определяет доступность ДНК для факторов транскрипции и РНК‑полимеразы: компактный — низкая транскрипционная активность (гетерохроматин), распущенный — высокая (эухроматин).
- Важные факторы:
- нуклеосомное размещение и плотность: нуклеосома охватывает $147$ bp ДНК; длина линкера ≈ $20$--$80$ bp; сдвиги нуклеосом изменяют доступность промоторов/энхансеров;
- посттрансляционные модификации гистонов (активирующие: H3K4me3, H3K27ac; репрессирующие: H3K27me3, H3K9me3) — влияют на связывание коактиваторов/ко‑репрессоров;
- метилирование ДНК (CpG) — препятствует связыванию TF и связывается с репрессорами;
- ремоделирующие комплексы (SWI/SNF и др.) и метко‑молекулы (CTCF, cohesin) — регулируют позиционирование нуклеосом и 3D‑архитектуру;
- трехмерная организация (A/B-компартменты, TADs размера $10^5$–$10^6$ bp или $100$ kb–$1$ Mb) задаёт контактность энхансер–промотор и влияет на выражение.
Методы для изучения в конкретной ткани (назначение, особенности для ткани)
- ATAC‑seq / snATAC‑seq — картирует открытую хроматиновую область; snATAC для гетерогенных или замороженных тканей; мало исходного материала.
- DNase‑seq — классический метод доступности; требует больше материала.
- MNase‑seq — нуклеосомное картирование (позиционирование нуклеосом).
- NOMe‑seq — одновременно доступность и метилирование ДНК по нуклеотиду.
- ChIP‑seq (или CUT&RUN/CUT&TAG) для гистоновых меток и TF — CUT&RUN/CUT&TAG предпочтительнее для низкого входа/тканей и нативного состояния; ChIP требует фиксации.
- WGBS / RRBS — полное / таргетное профилирование метилирования CpG.
- Hi‑C / Micro‑C — глобальная 3D‑карта контактов; Micro‑C лучше разрешение нуклеосомного уровня.
- HiChIP / PLAC‑seq / ChIA‑PET — контактные карты, обогащённые по маркёру (напр., H3K27ac) или белку (CTCF), полезны для связи энхансеров с генами.
- RNA‑seq / snRNA‑seq — измерение экспрессии; snRNA для структурно жёстких или замороженных тканей.
- Мультиомика (10x Multiome, SNARE‑seq и т.п.) — одновременно snRNA + snATAC, решает проблему гетерогенности.
- Валидация и функциональные тесты: CRISPRi/a, dCas9‑эпигенный редактор, удаление/мутирование энхансеров, люциферазные репортеры, RT‑qPCR, RNA‑FISH.
- Микроскопия: иммунореакция на гистоны, ДНК/RNA‑FISH, супер‑разрешение для визуализации компактизации.
Практические рекомендации для работы с тканью
- Учитывать гетерогенность: либо сортировать клетки (FACS, маркеры), либо применять single‑nucleus подходы.
- Сохранение хроматиновой структуры: для ChIP — аккуратная фиксация (формальдегид); для ATAC/CUT&RUN предпочтительна нативная подготовка или щадящая фиксация.
- Материал: для редких популяций — CUT&TAG, snATAC, single‑cell методы и маловходовые протоколы.
- Интеграция данных: объединять accessibility + histone marks + RNA + Hi‑C/HiChIP; искать дифференциальные пики, связывать энхансеры с генами через контакты; выполнять анализ мотивов для кандидатов TF.
- Контроль качества: фракция в сигнале для ATAC/ChIP, дубли по биологическим образцам, репликация.
Минимальная эффективная схема для исследования влияния структуры хроматина на экспрессию в ткани
1) snRNA‑seq + snATAC (или Multiome) для картирования клеточных типов и корреляции доступности с выражением.
2) CUT&TAG для ключевых маркёров (H3K27ac, H3K4me3, H3K27me3).
3) HiChIP по H3K27ac или Hi‑C для определения взаимодействий энхансер–промотор.
4) Функциональная валидация (CRISPRi/a, репортеры, RT‑qPCR).
Краткая аналитика
- Дифференциальная доступность/метка ↔ дифференциальная экспрессия (корреляция).
- Привязывать субъекты (пики/энхансеры) к генам через кольцевые контакты (HiChIP/Hi‑C) или ближайшее расстояние; использовать анализ мотива для поиска TF‑регуляторов.
- Идентифицировать изменения в 3D‑структуре (сдвиг компартментов, смена TAD) как возможную причину изменения регуляции.
Если нужно, могу предложить конкретный экспериментальный протокол для вашей ткани (указать тип ткани, доступный материал и цель — определить усиление/подавление конкретного гена).