Механизмы, приводящие к побочным структурным перестройкам при CRISPR–Cas9 в культуре стволовых клеток
- Двойные разрывы в ДНК (DSB) и пути их репарации:
- Непрецизионный NHEJ/alt‑EJ/MMEJ — быстрый лигазный ремонт с потерей или вставкой нуклеотидов, может приводить к небольшим делецям и к крупным реструктуризациям при неродственных конкатенациях концов.
- Долго-трассовый HDR/генетическая конверсии — при рекомбинации между некогерентными участками возможны LOH (loss of heterozygosity) и копийные перестройки.
- Множественные DSB (мультиплексирование) — одновременные разрывы на разных хромосомах дают транслокации, инверсии, фузии хромосом.
- Микрохомологичная репарация и репликационный стресс — приводит к большим делецям, инсерциям, повторным перестройкам и мульти-локусным ошибкам.
- Хромотрипсис и образования мостов/микроядра — однократная катастрофическая реструктуризация хромосомы при ошибочном репарировании фрагментов.
- Интеграция донорного или векторного ДНК (плазмиды, AAV, линейные доноры) — случайные вставки и конкатемеры в геноме.
- Репарация в контексте транскрипции/R‑loop — нестабильные участки более склонны к крупным перестройкам.
- Клеточный ответ на повреждение (p53) — селекция за клетками с нарушенным контролем ДНК (p53‑мутации) создаёт геномную нестабильность и клоническое доминирование аномальных линий.
Стратегические подходы для минимизации нежелательных геномных изменений
Дизайн и инструмент:
- Использовать тщательно подобранные и верифицированные sgRNA (алгоритмы предсказания off‑target; tru‑gRNA, химические модификации).
- Применять высокоспецифичные нуклеазы (Cas9‑HF1, eSpCas9, HypaCas9, HiFi Cas9) или альтернативы с лучшей специфичностью (Cas12a).
- При необходимости точечных замен — предпочесть без‑DSB методы: базовые редакторы (BE) или prime‑editing (PE), которые значительно снижают риск крупных SV (прямой риск уменьшен, но возможны другие побочки).
Доставка и режим экспрессии:
- Транзитное введение белок/sgRNA в виде RNP (минімізует время активности нуклеазы).
- Избегать плазмид/длительно экспрессирующих векторов; если нужен донор — предпочесть ssODN/длинную одноцепочечную ДНК (lssDNA) с минимальной вероятностью вставки.
- Минимизировать мультиплексирование DSB одновременно; планировать последовательные или селективные разрезы.
Модуляция путей репарации (с осторожностью):
- Синхронизация клеток в S/G2 для повышения HDR при точечных правках.
- Известные модификаторы (например, ингибиторы DNA‑PKcs) могут снизить NHEJ, но увеличивают риск альтернативных ошибок — применять только при полном понимании рисков и контроле.
- Использовать фьюжд‑конструкты (Cas9‑HR‑factors) и методы, направляющие ремонт к более точным путям, но валидация обязательна.
Культура, отбор и контроль качества:
- Минимизировать прохождение клеток и стресс культивирования; проверять и поддерживать геномную стабильность стволовых линий.
- Активно мониторить p53‑ответ; избегать и не селектировать клонов с дефектами p53.
- Клонирование и полная валидация каждого редактированного клона перед применением.
Комплексная стратегия валидации (обязательно):
- Коротко-ридинговое и преимущественно длинно-ридинговое секвенирование таргетной области (PacBio HiFi, ONT) для выявления больших делеций/инверсий/инсерций.
- Оптическая картография (Bionano) и/или karyotyping/FISH для обнаружения крупномасштабных перестроек и транслокаций.
- Глубокое WGS (или целевой WGS) + аналитика на структурные варианты; использовать алгоритмы, чувствительные к SV.
- Специфические методы off‑target скрининга: GUIDE‑seq, CIRCLE‑seq, SITE‑seq.
- PCR‑направленные методы: long‑range PCR, junction PCR, ddPCR/qPCR для контроля копийности и вставок в местах интеграции доноров.
- Функциональные тесты стволов (плюрипотентность, дифференцировка, рост, апоптоз) и мониторинг геномной стабильности в динамике.
Практические рекомендации (сводно)
- Приоритет: минимизировать DSB (использовать BE/PE) — если нельзя, то RNP + high‑fidelity Cas + оптимизированный sgRNA.
- Избегать плазмидных доноров; применять lssDNA или тщательно контролируемый AAV (учитывая риск интеграции).
- По возможности редактировать по одному локусу, избегать одновременных разрывов на разных хромосомах.
- Внедрить многоступенчатую QC‑политику с long‑read секвенированием и цитогенетикой перед использованием линий в экспериментах или терапевтических приложениях.
Коротко: основные источники перестроек — DSB и ошибочный ремонт (особенно при множественных разрывах и присутствии чужеродной ДНК); минимизировать риск можно через снижение частоты и времени действия DSB, использование без‑DSB редакторов, высокоспецифичных нуклеаз, аккуратную доставку доноров и многоуровневый контроль качества (long‑read, оптическая картография, cytogenetics, off‑target скрининг).