Способ расчёта Km и Vmax (кратко и по шагам)
1) Эксперимент:
- Измерьте начальные скорости реакции $v_0$ при ряде концентраций субстрата $[S]$ (минимум 8–10 точек, охватывающих $[S]\ll K_m$ до $[S]\gg K_m$), при фиксированной концентрации фермента, постоянной t и pH. Убедитесь, что измеряете начальные скорости (линейную фазу).
2) Модель:
- Базовая модель — уравнение Михаэлиса–Ментен:
$$v=\frac{V_{max}[S]}{K_m+[S]}$$
3) Рекомендованный метод расчёта:
- Нелинейная регрессия (наилучше — взвешенная МНК) подгоняет параметры $V_{max}$ и $K_m$ напрямую к уравнению Михаэлиса–Ментена. Это даёт наименьшую систематическую ошибку по сравнению с линеаризованными методами.
4) Альтернативные (линеаризованные) способы и формулы:
- Двойной обратный (Lineweaver–Burk):
$$\frac{1}{v}=\frac{K_m}{V_{max}}\cdot \frac{1}{[S]}+\frac{1}{V_{max}}$$ отсюда по наклону $m=\frac{K_m}{V_{max}}$ и пересечению $b=\frac{1}{V_{max}}$ получаем
$$V_{max}=\frac{1}{b},K_m=\frac{m}{b}.$$ - Eadie–Hofstee (построить $v$ против $v/[S]$):
$$v=V_{max}-K_m\cdot \frac{v}{[S]}.$$ - Hanes–Woolf (построить $[S]/v$ против $[S]$):
$$\frac{[S]}{v}=\frac{1}{V_{max}}[S]+\frac{K_m}{V_{max}}.$$ (у линеаризованных методов большие погрешности при ошибках в $v$; подходят для визуальной проверки, но предпочтительна нелинейная подгонка).
5) Связь с молекулярными константами:
- $V_{max}=k_{cat}[E_{tot}]$.
- При модельной механистике $E+S\stackrel{k_1}{\underset{k_{-1}}{\rightleftharpoons }}ES\stackrel{k_{cat}}{\to }E+P$,
$$K_m\approx \frac{k_{-1}+k_{cat}}{k_1}.$$
Как мутация активного сайта может изменить $K_m$ и $V_{max}$ и физиологические последствия
1) Варианты влияния мутации:
- Уменьшение каталитической константы $k_{cat}$ → уменьшение $V_{max}$ (при том же $[E_{tot}]$): ниже максимальная пропускная способность фермента.
- Изменение сродства к субстрату (изменение $k_1$ или $k_{-1}$):
- увеличение $K_m$ (снижение сродства) → нужна более высокая $[S]$ для достижения той же скорости;
- уменьшение $K_m$ (увеличение сродства) → фермент активен при более низких $[S]$.
- Комбинации: мутация может одновременно менять $k_{cat}$ и константы связывания, потому $K_m$ и $V_{max}$ могут изменяться независимо.
2) Физиологические последствия:
- Снижение $V_{max}$: уменьшение потока через путём → накопление субстрата и дефицит продукта; может ограничивать скорость критических метаболических путей, вызывать метаболические нарушения или компенсаторную сверхэкспрессию фермента.
- Увеличение $K_m$: при физиологических $[S]$ активность падает → также снижение потока; чувствительность к изменению концентрации субстрата повышается.
- Уменьшение $K_m$: фермент активен при низких $[S]$, возможна потеря гибкой регуляции и избыточное образование продукта.
- Изменение отношения каталитической эффективности $k_{cat}/K_m$ определяет конкурентоспособность фермента при низких $[S]$; снижение этой величины снижает эффективность при физиологических концентрациях.
- Клинически такие изменения могут приводить к ферментопатиям, блокаде метаболических путей, нарушению гомеостаза и патологическим последствиям.
Краткая рекомендация практику:
- Используйте нелинейную регрессию по уравнению Михаэлиса–Ментена; приводите доверительные интервалы для параметров; проверяйте на наличие аллостерии или подавления при высоких $[S]$.