Краткий план эксперимента и набор методов для определения субклеточной локализации белка (ядро / цитоплазма / мембрана). Для каждого метода — краткая процедура, контроль(ы) и ожидаемый результат.
Общие подготовительные шаги (рекомендации)
- Получить конструкцию белка с флуоресцентным тегом (GFP/ mCherry) как N- и C-концевые варианты; проверить функциональность. Трансфекция клеток на $24$-$48$ ч.
- Контрольные маркеры: ядро — Lamin A/C или DAPI; цитоплазма — GAPDH; плазм. мембрана — Na⁺/K⁺‑ATPase или WGA; органеллы — Calnexin (ER), Tom20 (митохондрии).
- Использовать живую микроскопию и фиксирование (PFA $4\%$, проницаемость Triton X-100 $0.1\%$) в зависимости от метода.
1) Конфокальная флуоресцентная микроскопия (живые клетки и/или фиксированные)
- Процедура: визуализация GFP‑фьюжена; ко‑клеточное окрашивание маркерами (DAPI, мембранные/органелльные антитела).
- Контроль: свободный GFP; маркеры компартментов.
- Ожидаемые результаты:
- Ядро: сильная колокализация с DAPI; сигнал внутри ядерной области.
- Цитоплазма: диффузный сигнал вне ядра, не колокализует с мембранными маркерами.
- Мембрана: яркая линия по периметру клетки / колокализация с мембранным маркером.
2) Иммунофлуоресценция (фиксированная) с/без пермеабилизации
- Процедура: окрашивание антителом к белку на непроницаемой (непермеабилизированной) и проницаемой клетке.
- Контроль: цитоплазматический белок и мембранный белок.
- Ожидаемые результаты:
- Мембрана (внешняя область): сигнал на непроницаемой клетке → внешний/плазматический локус.
- Внутренние компартменты (ядро/цитоплазма): сигнал появляется только после пермеабилизации.
3) Клеточная фракционизация + вестерн-блот
- Процедура: отделить цитозольную, ядерную и мембранную фракции (например центрифугирование/градиент), провести SDS‑PAGE и WB с антителом к белку.
- Контрольные белки: Lamin A/C (ядро), GAPDH (цитозоль), Na⁺/K⁺‑ATPase (мембрана).
- Ожидаемые результаты:
- Ядро: основной сигнал в ядерной фракции; слабый/отсутствует в цитозольной/мембранной.
- Цитоплазма: преимущественно в цитозольной фракции.
- Мембрана: обогащение в мембранной фракции; при трансмембранном белке — возможно смещение по молекулярной массе (гликозилирование).
4) Биотинилирование поверхностных белков (surface biotinylation) + вытяжка
- Процедура: обработать живые клетки мембрано‑непроницаемым биотином, вытянуть биотилированные белки стрептавидином и детектировать по WB.
- Контроль: внутриклеточный белок (не биотинилируется) и известный поверхностный белок.
- Ожидаемые результаты:
- Мембрана/поверхность: белок присутствует в биотин‑вытяжке.
- Ядро/цитоплазма: отсутствует в биотин‑фракции.
5) Протеазная защита / пермеабилизация в мембранных везикулах (ориентация доменов)
- Процедура: лизировать клетки в условиях сохранившейся мембранной топологии, обработать протеазой ± детергентом; анализ по WB.
- Ожидаемые результаты:
- Экстрацеликулярные домены мембранного белка — уничтожаются протеазой без детергента.
- Цитозольные/внутренние домены защищены, становятся доступны только после добавления детергента.
6) Иммуноголд‑электронная микроскопия (высокое разрешение)
- Процедура: фиксация, окраска антителами с коллоидным золотом, TEM.
- Ожидаемые результаты:
- Ядро: золотые частицы внутри/вокруг ядерной мембраны.
- Цитоплазма: распределение по цитозолю, вне ядра.
- Мембрана: концентрация частиц на мембранных структурах или плазм. мембране.
Дополнительные методы для подтверждения/динамики
- FRAP/FLIP (мобильность): мембранные белки обычно имеют ограниченную подвижность по сравнению с цитозольными; ядерные белки — дифференциальная мобильность в нуклеоплазме.
- Ко‑локализация с органелльными маркерами (ER/Golgi/митохондрии) для уточнения местоположения.
Интерпретация и предостережения
- Фиксация и теги могут менять локализацию — проверяйте оба терминальных фьюжена и живые клетки.
- Комбинируйте минимум два независимых метода (флуоресценция + биохимическая фракционизация или биотинилирование), чтобы исключить артефакты.
- Количественная оценка: для фракционирования рассчитывайте относительное обогащение (процент/кратность) по отношению к контрольным маркерам.
Если нужно — могу привести детальные протоколы (реагенты, буферы и концентрации) для одного выбранного метода.