Кратко — механизмы, примеры, методы.
1) Как это увеличивает функциональное разнообразие
- Альтернативный сплайсинг (АС) создаёт разные мРНК/белковые изоформы из одного гена за счёт включения/исключения экзонов, альтернативных 5'/3' сайтов, удержания интронов, взаимно исключающих экзонов, альтернативных промотеров/полиаденилирования; это меняет домены, мотивацию локализацию, комплексообразование, стабильность и регуляцию белков. Примерно $95\%$ многёкзонных генов человека подвергаются АС.
- Посттрансляционные модификации (ПТМ) — ковалентные изменения аминокислот (фосфорилирование, ацетилирование, убиквитинирование, гликозилирование, метилирование, липидирование, протеолиз и т.д.), которые изменяют активность, конформацию, срок жизни, локализацию и взаимодействия белка. Существуют $\gtrsim 200$ типов ПТМ.
- Взаимодействие: АС меняет набор остатков/мотивов, доступных для ПТМ (появляются/исчезают сайты модификации); ПТМ модифицируют сплайсинговые факторы и тем самым влияют на выбор сплайсинга.
2) Яркие примеры
- Drosophila Dscam — генерация очень большого числа вариативных изоформ ($\approx 38016$) для синаптической специфичности.
- CD44 — множество изоформ через включение вариабельных экзонов влияет на адгезию и метастазирование.
- BCL-X — альтернативный сплайсинг даёт Bcl-xL (антиапоптотический) и Bcl-xS (проапоптотический).
- p53 — комбинированные ПТМ (фосфорилирование, ацетилирование, убиквитинирование) контролируют стабильность и транскрипционную активность.
- Гистоны — ацетилирование/метилирование на хвостах (histone code) меняют экспрессию генов.
- Инсулин — протеолиза и дисульфидные мосты необходимы для созревания/функции.
- Tau — гиперфосфорилирование связано с агрегацией при болезни Альцгеймера.
3) Методы для изучения альтернативного сплайсинга
- RNA-seq (короткие риды) + инструменты для анализа сплайсинга: rMATS, SUPPA2, MAJIQ; количественная оценка изоформ — Kallisto, Salmon, StringTie.
- Длинные риды (PacBio Iso-Seq, Oxford Nanopore) для прямого определения полноразмерных транскриптов/изоформ.
- RT-PCR / qPCR с изоформо-специфичными праймерами; минигенные конструкторы (splicing reporters).
- CLIP-seq (HITS-CLIP, iCLIP, eCLIP) для картирования связывания РНК‑белков (сплайсфакторы).
- single-cell RNA-seq для клеточно-специфичного сплайсинга; Ribosome profiling (Ribo-seq) для проверки трансляции изоформ.
4) Методы для изучения ПТМ
- Масспектрометрия (LC‑MS/MS) — основной метод для идентификации и локализации сайтов ПТМ; топ‑даун протеомика для изучения комбинированных модификаций на одном молекуле.
- Энризмент для специфичных ПТМ: фосфопептиды (IMAC, TiO2), убиквитиновый «ди‑Gly» пептид‑энриджмент и т.п.
- Антитела к специфичным ПТМ (вестерн‑блот, IP, иммунопреципитация).
- Мутагенез (фосфомиметики/нефосфорилируемые замены) для функциональных тестов; протеазный картинг для картирования сайтиов клива.
- Гликопротеомика, протеометрические подходы для стехиометрии модификации.
- Proximity‑labeling (BioID, APEX) и фосфор‑/убиквитин‑протеомика для контекстной информации.
- Структурные методы (КРИО‑EM, рентген) для понимания эффекта ПТМ на конформацию.
5) Комбинированные подходы и ресурсы
- Совместное использование длинных ридов + фосфо‑/убиквитин‑протеомики и топ‑даун MS выявляет, какие изоформы реально модифицированы и функционируют.
- Базы и инструменты: UniProt, PhosphoSitePlus, dbPTM, Ensembl, GTEx; предикторы сайтов ПТМ: NetPhos, GPS.
Заключение (коротко): АС и ПТМ действуют на разных уровнях — генетико‑транскрипционном и белковом — и в сочетании дают экспоненциально больше функциональных состояний из одного гена; их изучают интегрированными методами транскриптомики, протеомики, молекулярной биологии и структурной биофизики.