Кратко: перечисляю приоритетные молекулярные гипотезы и практический план эксперимента для их дифференциации и валидации.
Гипотезы (каждая — короткое объяснение)
- Активация контрольных точек клеточного цикла через ДНК‑повреждение / p53 → повышенный p21, блок G1/S или G2/M.
- Репликационный стресс → активация ATR/CHK1 и замедление S‑фазы.
- Ослабление митогенных сигналов (EGF/PDGF → PI3K/AKT/mTOR или RAS/ERK) — снижение синтеза циклинов.
- Метаболический стресс / низкий ATP → активация AMPK и торможение роста.
- Окислительный стресс (повышенный ROS) — косвенная активация чекпойнтов.
- Секретируемые ингибиторы (например, TGF‑β) в среде — паракринная антипролиферация.
- Нарушение протеостаза или рибосомогенеза → снижение уровней циклинов/CDK.
- Изменение регуляторных РНК (miRNA) или эпигенетика, подавляющие цикл.
- Инфекция/контаминант (микоплазма/вирус) вызывают функциональную блокаду деления.
План эксперимента (структурировано, с ключевыми тестами и контролями)
1) Базовая верификация фенотипа (быстро: $n=3$ биол. повторы)
- Пролиферация: EdU или BrdU инкорпорация; время точки: $0,12,24,48\text{ч}$.
- Клеточный цикл: PI/DAPI FACS для долей G0/G1, S, G2/M.
- Апоптоз/жизнеспособность: Annexin V/PI.
- Сенесценция: SA‑β‑gal окраска.
Ожидаемое: снижение EdU и увеличение доли в конкретной фазе (укажет точку блокировки).
2) Чекпойнты и ДНК‑повреждение
- γH2AX флуоресценция / количество ядерных foci; комет‑ассай.
- WB/qPCR: p53, p‑p53, p21, p16, p27, p‑CHK1, p‑CHK2.
Интерпретация: ↑γH2AX и ↑p21/p‑CHK1 → ДНК/репликационный стресс.
3) Митогенные сигналы и синтез белка
- WB: p‑AKT, p‑ERK, p‑mTOR (p‑S6), уровни циклинов D/E/A/B и CDK2/4/6.
- Добавочный тест: кратковременное добавление EGF $20\text{нг/мл}$ и измерение восстановления проллиферации через $24\text{ч}$.
Интерпретация: снижение p‑AKT/p‑ERK и восстановление при EGF ⇒ недостаток митогенных сигналов.
4) Метаболизм и ROS
- ATP‑люминесценция; соотношение NAD+/NADH; глюкоза‑лактат в среде.
- AMPK (p‑AMPK) WB; измерение ROS (H2DCFDA) и митохондр. потенциала (JC‑1).
- Тест на восстановление: NAC $5\text{мМ}$ или доноры энергии (питание) — проверка восстановления деления через $24\text{–}48\text{ч}$.
Интерпретация: низкий ATP / ↑p‑AMPK / ↑ROS и восстановление при NAC → метабол./окисл. стресс.
5) Секретируемые факторы и среда
- Анализ кондиционированной среды: ELISA для TGF‑β, IL‑6; проба «кондиционированная среда» на свежей культуре.
- Замена/обмен среды на свежую и пересеевание при низкой плотности — быстрый тест на обратимость.
Интерпретация: эффект кондиционированной среды и возврат после замены → паракринный фактор.
6) Протеасома / рибосомы / транслция
- Уровень убиквитинирования, активность протеасомы; полисиомный профиль / rRNA уровни.
- WB уровней циклинов при ингибиторе протеасомы (контроль).
Интерпретация: снижение трансляции/рибосомальной активности → падение циклинов без морфологии.
7) РНК/эпигенетика/miRNA
- qPCR массив для ключевых miRNA и транскриптов циклинов/ингибиторов; при необходимости small‑RNA seq.
- Тесты восстановления: антисмысловые ингибиторы miRNA или экспрессия циклина D/E.
Интерпретация: специфические изменения miRNA, коррелирующие с падением циклинов — подтверждение.
8) Контаминанты/инфекции
- Mycoplasma PCR, тесты на обычные вирусы, измерение IFN‑индуцируемых генов.
Интерпретация: положительная детекция → причина замедления.
9) Функциональные rescue‑эксперименты (ключ к доказательству причинности)
- p53/p21 knockdown (siRNA) или ингибитор p53 (pifithrin‑α $20\mu \text{M}$) — восстановление деления подтвердит p53‑зависимость.
- Добавление EGF или активация mTOR (условно) — тест митогенной гипотезы.
- NAC $5\text{мМ}$ — тест ROS.
- Нейтрализация TGF‑β антителом — тест парокринной гипотезы.
Условия контроля: несущая РНК/неконкретный siRNA, vehicle‑контроль.
Статистика, реплики и временная шкала
- Биологические реплики: $n=3$ минимум; технические по необходимости.
- Временные точки: базовая оценка $0,12,24,48\text{ч}$; для восстановления после вмешательств $24\text{–}72\text{ч}$.
- Критерии: значимое снижение EdU на $>50\%$ и соответствующие изменения маркеров считать релевантными; статистика t‑test или ANOVA, p‑значение порог $p<0.05$.
Краткая логика интерпретации результатов
- Если ↑γH2AX/p‑CHK1/p21 → первичная гипотеза: ДНК/репликационный стресс.
- Если ↓p‑AKT/p‑ERK и восстановление при EGF → дефицит митогенных сигналов.
- Если низкий ATP/↑p‑AMPK и эффект от доноров энергии → метаболический стресс.
- Если эффект переносится кондиционированной средой и нейтрализуется антителом → секретируемый ингибитор (напр. TGF‑β).
- Rescue‑эксперименты (siRNA/ингибиторы/доноры) дают причинное подтверждение.
Если нужно, могу предложить конкретные наборы антител, праймеров и концентрации для ключевых тестов.