Кратко и по делу — план генетического исследования для семей с несколькими детьми с предполагаемой моногенной аутосомно-рецессивной болезнью.
1) Клиника, сбор данных, этика
- Тщательная фенотипизация (стандартизованные HPO-термины).
- Составление родословной, уточнение степени родства (консангвинность).
- Получение информированного согласия (включая секвенирование, хранение данных, возможную публикацию/шеринги).
2) Материалы
- DNA из крови (рекомендуется) у: всех больных, обоих родителей, по возможности здоровых братьев/сестёр и дальних родственников с/без признаков.
3) Первичные лабораторные тесты (исключить другие причины)
- Хромосомный микромассив / SNP-array для поиска копийных вариантов (CNV) и для анализа участков гомозиготности (ROH), особенно при консангвинности.
- Если подозрение на грубые хромосомные аномалии — karyotype/реже FISH.
4) Непосредственно молекулярная стратегия
- 1-й выбор: тройное экзомное секвенирование (WES) — минимум: оба родителя + один(два) больных. При возможности секвенировать всех больных и родителей (best).
Обоснование: высокая экономичность для выявления кодирующих вредных вариантов (LOF/missense).
- Альтернатива/дополнение: whole-genome sequencing (WGS) если WES отрицателен или есть подозрение на невключённые в экзом события (структурные варианты, интроны, промоторы, повторные элементы).
- Для поиска больших CNV/структурных вариантов дополнительно/вместо — высокоплотный SNP-array или анализ CNV из WES/WGS.
5) Технические требования
- Для WES — средняя глубина покрытия рекомендация $>50\times$ (лучше $>100\times$).
- Для WGS — глубина $\sim 30\times$ как стандарт; для детекции мозаицизма/сложных событий — глубже.
6) Аналитический пайплайн (кратко)
- Выравнивание: BWA-мему; вызов вариантов: GATK Best Practices (или аналог).
- Аннотация: VEP/ANNOVAR; частоты: gnomAD, 1000G, локальные базы.
- Фильтрация (модель аутосомно-рецессивного наследования):
- Исключить варианты с частотой в популяции выше порога, например $\text{AF}>0.001$ (или строже $<0.0001$ для редких болезней).
- Выделить: гомозиготные редкие варианты, либо компаунд-гетерозиготные в одной гене (проверьте передачу в транс).
- При консангвинности приоритет гомозиготным вариантам, расположенным внутри больших ROH (анализ ROH: PLINK/HomozygosityMapper).
- Приоритет по эффекту: loss-of-function (nonsense, frameshift, canonical splice) > тяжёлые missense (CADD, REVEL, PolyPhen, SIFT) > спайс-предсказания (SpliceAI).
- Для кандидатов смотреть экспрессию гена в релевантных тканях, данные животного/функциональные публикации, известные фенотипы в OMIM/ClinVar/HGMD.
- Для больших семейств: можно сделать параметрический linkage-анализ (рецессивная модель) для определения регионов с LOD > $3$ как сильный сигнал (требует достаточного числа ситуативных членв).
7) Валидация и секвенирование сегрегации
- Сегрегация кандидата проверяется Sanger-ом у всех доступных членов семьи (подтвердить гомозиготность у больных и носительство у родителей).
- Для компаунд-гетерозигот — убедиться, что варианты в транс (фаза определяется по родителям или фаглированием).
8) Если WES ничего не дал
- Рассмотреть WGS (структурные варианты, интронные/регуляторные варианты, повторные последовательности).
- Тесты на эпи- и митохондриальные вариации (если клинически показано), анализ сплайсинга с RNA-seq из релевантной ткани (если доступно) для проверки эффектов на экспрессию/сплайсинг.
- Поиск трёхмерных структурных перестроек, повторов, фенотипически релевантных ремарок.
9) Интерпретация и функциональная проверка
- Классификация по ACMG/AMP-критериям.
- Для новых генов/вариантов — клеточные/биохимические исследования, моделирование in vitro/in vivo, восстановление функции (резюме предложенных экспериментов зависит от гена/патогенеза).
- Поиск по базам (GeneMatcher, DECIPHER) для подтверждения фенотипического соответствия у других групп.
10) Пакет итоговых рекомендаций
- Последовательность действий: SNP-array + WES тройки/множественных больных → bioinformatic фильтрация по рецессивной модели + ROH → Sanger-сегрегация → при необходимости WGS/RNA-seq/функциональные тесты.
- Документирование и консультация семьи по результатам, генетическое консультирование (риск рецидива, пренатальная/PGT варианты).
Инструменты/ресурсы (рекомендуемые): BWA, GATK, bcftools, PLINK, HomozygosityMapper, VEP/ANNOVAR, CADD/REVEL/SpliceAI, Exomiser, GeneMatcher, gnomAD, OMIM, ClinVar.
Если нужно, могу предложить конкретную пошаговую команду фильтрации для VCF (пример фильтров) или шаблон отчёта.