Краткая модель (биологический механизм)
- Начальный эффект: при переменных субинхибирующих концентрациях происходит отбор вариантов с умеренной устойчивостью (регуляторные мутации, повышение экспрессии насосов выведения, модификация проницаемости), потому что такие изменения дают преимущество при низких дозах.
- Ускорение дивергенции: стрессовые циклы индуцируют SOS/стрессовые ответы и/или отбирают «mutator»-клоны, что повышает частоту генетических изменений и появление дополнительных мутаций, дающих высокую устойчивость.
- Горизонтальный перенос: субинхибирующие дозы могут способствовать передаче плазмид/интегонов (конъюгация, трансформация), приводя к приобретению множественных генов резистентности.
- Кумуляция: сочетание регуляторных мутаций + модификаций целей антибиотиков + приобретённых плазмидов даёт множественную устойчивость и кросс-резистентность (например, универсальные насосы).
Как проверить экспериментально (план проверок, коротко и конкретно)
1. Сэмплирование по времени
- Отобрать пробы по поколениям/дням: например, каждые $24$ ч или каждые $\sim 10$ поколений и сохранить исходный штамм и промежуточные выборки.
2. Геномный анализ
- WGS (краткая: Illumina, глубина $>100\times$) на исходном, нескольких промежуточных и финальном штаммах.
- Что искать: точечные мутации в генах-мишенях, регуляторах, мутациях mutS/mutL, новые контigs/плазмиды, интегоны.
- Оценить частоты вариантов в популяции (variant allele frequency).
3. Плазмидная/мобильная генетика
- Экстракция плазмидов, S1-PFGE или long-read (Nanopore) для сборки плазмидов.
- Конъюгация/трансформация: попытка передать резистентность на приёмный штамм; определение коэффициента передачи.
4. Функциональная валидация мутаций
- Реконструкция кандидатов (аллический обмен или CRISPR) в предковом фоне и измерение MIC; подтвердить, что мутация повышает устойчивость.
- Плазмидное «выпалывание» (curing) финального штамма: если устойчивость падает — роль плазмидов.
5. Проверка повышенной мутагенности и SOS
- Флаксационная проба (Luria–Delbrück) для оценки скорости мутаций; оценка мутационной скорости: $\mu =\frac{-\ln P_0}{N}$, где $P_0$ — доля колоний без мутантов, $N$ — число клеток.
- PCR/seq мутаций в mutS/mutL; SOS-репортер (например, sulA‑GFP) — измерить индукцию при экспозиции.
6. Транскриптомика/экспрессия
- qPCR или RNA‑seq для насосов выведения, поринов и глобальных регуляторов (MarA, RamA и т.д.). Тест с ингибитором насосов (напр., PAβN): если MIC снижается при ингибиторе — вклад насосов.
7. Фенотипические тесты
- Измерение MIC/МКБ при разных антибиотиках для картирования кросс-резистентности.
- Persister assay (выживаемость после высокой дозы) — чтобы оценить вклад персистенции.
- Фитнес-тесты в отсутствие антибиотика (конкуренция с предком) — оценка затрат.
8. Контрольные эволюционные эксперименты
- Параллельные линии: постоянное субинхибирование, переменное субинхибирование, отсутствие антибиотика — сравнить траектории мутаций и механизмы.
Критерии вывода (как интерпретировать)
- Если WGS показывает преимущественно хромосомные точечные мутации и mutator-маркеры → эволюция через накопление мутаций.
- Если обнаружены новые плазмиды/генные кассеты и передача на рецепторы успешна → HGT.
- Если существенно повышена экспрессия насосов и ингибитор меняет MIC → регуляторные/эффлюкс-механизмы.
- Совместное наличие мутаций + плазмидов говорит о комбинированном механизме.
Это короткий проверяемый набор гипотез/экспериментов для идентификации механизма возникновения множественной устойчивости.