Кратко и по сути — план действий с методами и обоснованием.
1) Подтверждение фенотипа и исключение внешних причин
- Повторные поведенческие тесты: CAFE-ассай, пробосцис-экстеншн (PER), двухфакторный выбор пищи (с/без сахара, горького), время кормления, потребление в пересчёте на массу.
- Контроль условий: пища, влажность, температура, возраст, пол, плотность.
- Микробиом/паразиты: сравнить стерильных и обычных (гнотобиоз), PCR/метагеном для вирусов, Wolbachia, грибков — изменения микробиоты могут давать поведенческие сдвиги.
2) Генетические подходы — определить наследуемость и локус
- Наследование: скрещивания мутантной линии с контрольной (reciprocal crosses) — выяснить доминантность/рецессивность, сцену сцепления с полом.
- Сегрегационный анализ: проследить фенотип в F1/F2/Backcross для оценки числа локусов.
- Комплементационные тесты: скрещивания с существующими мутантами/дефишенси-штаммами (deficiency kit) для быстрой локализации по хромосомам.
- Классическое картирование рекомбинацией: использовать баланcеры и маркеры, если нужен локус в сотнях килобаз.
- Mapping-by-sequencing / Bulk segregant analysis (BSA): скрестить мутант с полиморфной линией, отобрать по фенотипу крупные пула особей, секвенирование пулов → сдвиг частоты аллелей укажет на область. Это быстрый современный метод для одномутантной причины.
- Целевое WGS одного мутанта: поиск новых SNP/индлов/структурных вариантов, смотреть на кандидаты в кодирующих/регуляторных областях.
- Проверка активности подвижных элементов/TE и хромосомных перестроек (репликационные/инсерционные события): анализ WGS и PCR.
- Валидация: CRISPR/Cas9-ремонт мутантного аллеля (reversion) или рекреация мутации в контрольном фоне; восстановление фенотипа — причинно.
3) Функциональная валидация генов и нейронных субпопуляций
- Трансгенный рескью: экспрессия WT-копии кандидата (UAS-ген) в мутантном фоне с подходящими GAL4-драйверами; обратный эффект — подтверждение локуса.
- RNAi/overexpression-скрины по кандидатам и библиотекам генов, связанные с питанием (Gr-гены — вкусовые рецепторы, for — foraging, npf/npfr1, sNPF, DopR, takeout, AKH/AKHR и др.).
- Мозаичный анализ (MARCM): локализация действия гена в отдельных нейронах/кластерах — выявляет клеточно-автономность и локус в мозге.
4) Нейробиологические методы — где в нервной системе изменение
- Локализация анатомически: использовать GAL4/split-GAL4 линии, маркеры нейромедиаторов (NPF, dopamine, serotonin, insulin-like peptides), иммуноокраску, GFP-репортеры. Особое внимание — SEZ (subesophageal zone), вкусовые сенсоры, центры мотивации (NPF/NPFR, dopaminergic neurons).
- Функциональная запись: calcium-imaging (GCaMP) в специфичных нейронах при подаче пищи/вкусовых стимулов; сравнение активности мутант/контроль.
- Оптогенетика/термогенетика: активация/ингибирование нейронных популяций (Channelrhodopsin, CsChrimson, dTRPA1, Shibire^ts) чтобы воспроизвести или подавить фенотип — локализация «контролирующих» клеток.
- Электрофизиология: запись от вкусовых сенсоров (GRNs) и мотонейронов пробосциса при стимуляции — проверить сенсорный vs центральный дефект.
- Поведенческие корреляты: латентность к началу кормления, мотивация (глюкозо-зависимость), сатиация — отличают изменения в мотивации/восприятии/моторике.
- Транскриптомика: bulk RNA-seq или single-cell RNA-seq мозгов/SEZ для поиска дифференциальной экспрессии; особенно полезно, если мутация регулирует экспрессию.
- Connectomics / EM (при необходимости): если подозрение на перестройку синапсов в определённой микросхеме.
5) Комбинированная стратегия (рекомендуемая последовательность)
- 1) подтвердить фенотип и исключить среду/микробиоту; 2) оценить наследование; 3) параллельно начать BSA/WGS для локализации и комплементационные тесты; 4) по кандидату — CRISPR-ремонт/рескью; 5) локализовать нейронную систему с помощью GAL4/split-GAL4, GCaMP и оптогенетики; 6) MARCM для клеточной точности. Всегда держать контролируемые реплики и вернуть линию в нормальные условия для проверки стабильности фенотипа.
6) Возможные нетипичные причины, которые стоит проверить
- Эпигенетические/регуляторные изменения, перестройка промоторов/enhancer’ов.
- Вставки трансгенов/конструкций лаборатории.
- Соматические мутации или химеризм в линии (если фенотип не наследуется стабильно).
- Вирусные/паразитарные инфекции, изменения микробиоты.
Краткий итог: сочетайте классическую генетику (наследование, комплементация, картирование) и современное секвенирование (BSA/WGS) для быстрой локализации гена; затем используйте трансгенные инструменты (CRISPR, рескью, RNAi) и нейронаучные методы (GAL4/split-GAL4, GCaMP, оптогенетика, MARCM, electrophysiology) для определения клеточного и мозгового локуса и механизма изменения кормового поведения.