Эксперимент (план, отбор, анализ)
- Цель: сравнить микробные сообщества и их функции в водоёме при разной антропогенной нагрузке и выявить маркеры загрязнения.
- Дизайн отбора:
- Выбрать контрольную зону и зоны с разной нагрузкой (например, сельхозсток, городская канализация, промышленный слив). Рекомендуем число точек: контрольные $m=2$, влияющие $m=3$.
- Пространственная репликация: на каждой точке взять независимых проб $n=3$.
- Временная репликация: минимум две сезонные серии (весна/лето) или месячный мониторинг при острых выбросах.
- По глубине/профилю: поверхностная вода и донные отложения, если релевантно.
- Отбор проб и контролей:
- Объём воды для фильтрации: $1\mathrm{L}$ (регулируйте по турбидности).
- Фильтры 0.22–0.45 μm для бактерий/архей; отдельные пробы для вирусов (0.02 μm) если нужно.
- Негативные (поле/реагентные) и положительные (мок-коммьюнити) контролы; встречно-балансированный randomized отбор.
- Метаданные и химия:
- Параметры: температура, pH, DO, проводимость, нитраты/фосфаты, БПК/ХПК, токсичные соединения (ПАУ, тяжелые металлы, антибиоти-ки), показатели стока.
- Физико-химические данные фиксировать синхронно с биопробами.
- Лаборатория и секвенирование:
- Экстракция ДНК стандартизированным методом с контролем эффективности.
- Добавить внутренний стандарт (spike-in) для оценки абсолютных копий (напр., известный ген/штамм).
- Shotgun метагеномное секвенирование: целевая глубина $2\times 10^7$ парных ридов/пробу (регулируется по цели и бюджету).
- Альтернативы/дополнения: 16S для быстрой таксономии; метатранскриптомика для активности.
Аналитика (биоинформатика и статистика)
- Предобработка: QC (Trimmomatic/fastp), удаление хост-контаминации, контроль контамов.
- Таксономия:
- Рид-ориентированные профайлеры (Kraken2, Kaiju) и/или маркерные (MetaPhlAn).
- Сборка и биннинг для MAGs (MEGAHIT/Metaspades → MetaBAT/CONCOCT), оценка качества (CheckM).
- Функции:
- Аннотация генов (Prodigal → eggNOG/KEGG/UniRef), профиль путей (HUMAnN3), поиск ARG (CARD, ResFinder), MGE/плазмиды (PlasFlow, MOB-suite), токсин/патоген базы (VFDB).
- Нормализация:
- Релятивные абундансы (TPM/RPKM) и абсолютные оценки с использованием spike-in (копий/мЛ).
- Статистика:
- Альфа-разнообразие (Observed, Shannon), бета-разнообразие (Bray–Curtis, PCoA), PERMANOVA для значимости.
- Дифференциальная абунданс (DESeq2, ANCOM), скорректировать множественные сравнения (FDR; значимость, напр., $q<0.05$).
- Indicator species/genes и SourceTracker для источников загрязнения.
- Сетевая аналитика для ко-ассоциаций и выявления потенциальных носителей ARG.
Интерпретация возможных изменений
- Снижение альфа-разнообразия:
- Интерпретация: экологическое стресc/отбор в сторону устойчивых к загрязнению таксонов; чаще при острой/хронической нагрузке.
- Сдвиг в составе (увеличение оппортунистов и патогенов):
- Повышение доли Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Aeromonas → признак фекального/городского стока.
- Увеличение кишечных индикаторов совместно с нитратами/фосфатами указывает на канализационный/сельхозный источник.
- Изменения функционального профиля:
- Увеличение генов деградации ксенобиотиков (категории KEGG, пути P450) → наличие органических загрязнителей/ПАУ/ПАВ.
- Увеличение денитрификации, нитратредукции, сульфатредукции → ответ на избыток органики/редокс-условия (эвтрофикация, гипоксия).
- Увеличение метановыделяющих генов (mcrA) → восстановление, анаэробные зоны.
- Рост ARG и MGE:
- Значительное повышение количества генов резистентности и мобильных элементов — индикатор ввода антибиотиков/фекальных матриц и повышенного риска горизонтального переноса.
- Появление токсигенных цианобактерий:
- Увеличение таксонов Cyanobacteria и генов синтеза токсинов (sxt, mcy) → риск цветения и токсичности воды.
- MAGs и патогенны:
- Нахождение полноценных MAGs с факторами вирулентности или ARG в плазмидах — сильный сигнал антропогенного влияния и потенциальной угрозы для здоровья.
Контекст и ограничения
- ДНК фиксирует живые и мертвые клетки и свободную ДНК — для активности используйте метатранскриптомику или qPCR целевых генов.
- Корреляция ≠ причинность — связывайте изменения с химическими параметрами и источниками.
- Рекомендация проверки ключевых маркеров (патогены, ARG, токсины) целевыми методами (qPCR, культура) для подтверждения риска.
Краткие практические пороги/правила:
- Реплики: $n=3$ на точку; контрольные $m=2$, влияющие $m=3$.
- Секвенирование: примерно $2\times 10^7$ парных ридов/пробу.
- Статистика: значимость при $q<0.05$.
Используйте сочетание таксономии, функциональной аннотации, абсолютной нормализации (spike-in) и химических данных для интерпретации источников и последствий антропогенной нагрузки.