Кратко — возможные клеточные механизмы и конкретные способы их экспериментальной проверки.
1) Провал цитокинеза (кариокинез произошёл, плазмодема не разделилась)
- Механизм: дефекты актомиозинового кольца, RhoA/ECT2, Anillin, миозин-II или нарушенный абскёзис (ESCRT‑III, CEP55, ALIX).
- Тесты:
- Живая микроскопия: метка хроматина (H2B‑GFP) + мембраны (PH‑GFP/CAAX) или LifeAct‑GFP — смотреть: деление хромосом без смыкания мембраны/отсутствие абскёзиса.
- Иммуноокраска/локализация: RhoA, ECT2, Anillin, p‑MLC (фосфо‑миозин), CEP55, CHMP4B, MKLP1 — нарушение локализации на пятне деления или на мидбоди.
- Функционально: siRNA/CRISPR по ECT2/Anillin/CHMP4B или резкий ингибитор (ROCK ингибитор, ESCRT‑блокаторы) — моделирование фенотипа; восстановление экспрессии — рескью.
- Ожидаемый результат: при цитокинезном дефекте — нормальная хромосомная сегрегация, формирование двух ядер в одном клеточном теле; накопление мидбоди‑маркерov.
2) Митотический арест с последующим «slippage» (продолжительная активность SAC → выход в G1 без деления)
- Механизм: длительная активация контрольной точки собрания веретена (SAC), затем деградация циклин B и возврат в интерфазу без цитокинеза → многоядерность/тетра- или полиплоидия.
- Тесты:
- Живая микроскопия: отметить длительность метафазы/анафазы; если задержка → затем «slippage».
- Окраска на фосфо‑Histone H3 (Ser10) и уровень циклина B1 (WB) — высокая/продолжительная индексация SAC; снижение циклин B при «slippage».
- Третирование ингибитором MPS1 или Mad2 knockdown — если фенотип уменьшается, вовлечен SAC.
- Ожидаемый результат: увеличенное время митоза; затем клетки выходят в интерфазу с увеличенным содержанием ДНК.
3) Нарушение веретена / центросомная амплификация → многополярные веретена → неправильная сегрегация и цитокинезный провал
- Механизм: амплификация центросом, дефекты кинацор/микротрубочек (Aurora A/B, PLK1, KIF) → мультиполярные деления, неравномерное распределение ДНК, образование многоядерных клеток.
- Тесты:
- Иммуноокраска центросом: Centrin, γ‑tubulin, Pericentrin — подсчёт центросом (>2).
- Окраска микротрубочек (α‑tubulin) и кинетоходных белков; оценка полярности веретена (микроскопия).
- Ингибиторы Aurora A/B, PLK1; knockdown соответствующих генов — воспроизведение/изменение фенотипа.
- Ожидаемый результат: многополярные веретена, асимметричная сегрегация хромосом, повышенная анеуплоидность.
4) Нарушения абскёзиса / ESCRT‑функции (последний этап деления)
- Механизм: мидбоди сформирован, но окончательное рассоединение не происходит (дефекты CHMPs, spastin).
- Тесты:
- Иммуноокраска мидбоди‑маркеров (CEP55, ALIX, CHMP4B, Spastin) — удержание мидбоди, отсутствие CHMP загрузки.
- EM или высокоразрешающая микроскопия — незавершённый абскёзис.
- siRNA/overexpression of ESCRT components — проверка необходимости.
- Ожидаемый результат: постоянные межклеточные мостики, множественные ядра в одном цитоплазматическом объёме.
5) Клеточное слияние (фузогенные белки, вирусная инфекция)
- Механизм: сегрегация клеток/слияние соседей даёт многоядерность без деления.
- Тесты:
- Микроскопия живых клеток; метки мембран/цветовые метки для разных популяций (например, смешать клетки с дифференцированными флуорофорами) — при слиянии появятся клетки с обоими маркерами.
- PCR/IFA на вирусные белки или экспрессию синцитина/фузогенных белков.
- Ожидаемый результат: смешанное мембранное/цитоплазматическое наполнение маркеров.
6) Репликация ДНК без митоза (эндорепликация / эндомитоз)
- Механизм: клетка переходит в цикл, в котором происходит репликация без митоза → поли-/мультиядерность.
- Тесты:
- BrdU/EdU инкорпорация + подсчёт клеток с >$2N$ ДНК по FACS (PI/DAPI). Оценить содержание $2N$, $4N$, >$4N$.
- Oкраска для циклин E/A, p21, p53; проверка нарушений регуляторов G2/M (CDK1 Tyr15).
- Ожидаемый результат: увеличение популяций с $4N$ и >$4N$, EdU‑положительные клетки без митотических маркеров.
7) Повреждение ДНК / стресс, приводящий к удлинению митоза и мультиядерности
- Механизм: DSB/репликационные стресс → активация ATM/ATR — замедление прогрессии, возможные дефекты деления.
- Тесты:
- Маркеры повреждений: γH2AX, 53BP1.
- Тесты на восстановление/ингибирование ATM/ATR; оценка влияния на митотическую длительность.
- Ожидаемый результат: повышенные маркеры повреждения, удлинённая митотическая фаза.
Общие диагностические наборы (рекомендуемые первый набор экспериментов)
- Живая микроскопия (H2B‑GFP + мембранная метка или LifeAct) — определить, на каком шаге останавливается процесс (метафаза, анафаза, цитокинез, абскёзис, слияние).
- FACS (PI/DAPI) для оценки ДНК: доли $2N$, $4N$, >$4N$.
- Иммунокраска для: α‑tubulin, γ‑tubulin/centrin, Ph‑H3 (Ser10), RhoA/ECT2, Anillin, Aurora B, CEP55, CHMP4B, γH2AX.
- Вестерн‑блот: циклин B1, CDK1 (Tyr15), Aurora B, PLK1, p53, p21.
- Функциональные вмешательства: siRNA/CRISPR по подозреваемым генам и ингибитор/активатор (MPS1, Aurora, PLK1, ROCK) — посмотреть смену фенотипа.
Интерпретация: живая микроскопия + маркеры цитокинеза/мидбоди отличают «непроизвёлся цитокинез» от «нарушение веретена/слippage» или «слияния». FACS и karyotype/FISH подтверждают полиплоидию/анеуплоидию.
Если нужно, могу предложить конкретную последовательность экспериментов и панели антител/репортеров для вашей линии.