Кратко и по делу — предложения по планированию, рандомизации, анализу, проверке воспроизводимости, систематическим ошибкам и интерпретации причинно‑следственных выводов для эксперимента с контрольной группой и $3$ концентрациями микропластика.
1) Дизайн эксперимента
- Группы: контроль + $3$ уровня концентрации (итого $4$ уровня).
- Репликация: минимум $5\text{–}8$ биологически независимых реплик на уровень (точное $n$ рассчитывать через power‑анализ).
- Блокирование: использовать Randomized Complete Block Design (RCBD) или блоки по времени/пластинам/партиям культуры, если имеются известные источники вариабельности.
- Временной дизайн: если измеряете рост во времени — либо анализировать параметры кривой (µmax, lag) для каждой реплики, либо применять повторные измерения (см. далее).
- Контроль условий: поддерживать одинаковые свет, температуру, питание, начальную плотность клеток, размер/форма/состав частиц.
2) Рандомизация и слепота
- Рандомизировать распределение уровней по сосудам/колодцам внутри каждого блока случайно.
- При измерениях по возможности применять слепые/анонимные образцы (оператор не знает обработки).
- Перемешивание позиций на шельфе/плате между повторными запусками.
3) Измерения и контроль экспозиции
- Качество изобразителей: фиксировать и контролировать концентрацию частиц во времени (анализировать остаточную концентрацию), размер, форма, состав, агрегацию.
- Контролировать возможные ли‑чеаты/адъитивы (проверка на химические загрязнения).
- Включить отрицательные и положительные контрольные условия (например, нулевой микропластик и известный токсин/стимул).
- Замеры метаболизма: детерминировать заранее какие метки (например, хлорофилл, дыхание, фотосинтез, метаболиты) и стандартизировать методики.
4) Статистический план анализа
- Модель базовая (односторонний эффект уровня):
$$Y_{ij}=\mu +{\tau }_i+{\epsilon }_{ij},{\epsilon }_{ij}\sim N(0,{\sigma }^2)$$
где $i$ — уровень (контроль + $3$ концентрации), $j$ — реплика.
- Если есть блоки: использовать смешанную модель:
$$Y_{ijk}=\mu +{\tau }_i+b_k+{\epsilon }_{ijk},b_k\sim N(0,{\sigma }_b^2)$$ - Для повторных измерений во времени: линейная смешанная модель с фикси­рованными эффектами времени и взаимодействием (или GAM/неровные модели для кривых роста).
- Проверки: ANOVA (или LMM), затем парные сравнения с контролем через Dunnett для множественных сравнений. Для тренда используйте тест линейного тренда/контрасты или регрессию на непрерывную концентрацию (см. ниже).
- Если данные не нормальны — применять трансформации (лог), обобщённые ЛММ (напр., Poisson/NegBin/гауссово с robust SE) или непараметрические тесты.
- Оценки эффектов: сообщать средние ± $95\%$ CI и эффекты размера (разность средних, относительное изменение), не только p‑значения.
5) Моделирование доза‑ответа
- Рассматривать концентрацию как непрерывную переменную в регрессии (лог‑линейная или нелинейная). Пример Hill‑функции:
$$f(c)=E_0+\frac{E_{\max }{c}^h}{E{C}_{50}^h+c^h}$$
Оценить параметры $E{C}_{50}$ или $E{C}_{10}$ с доверительными интервалами.
- Трендовые контрасты (ортогональные полиномы) полезны при равноудалённых уровнях.
6) Множественная проверка гипотез
- При сравнении всех групп с контролем — Dunnett. При множественных эндпойнтах — корректировка (Benjamini‑Hochberg для FDR или Bonferroni при строгой коррекции).
- Отчёт о множественных тестах: указывать скорректированные p и необработанные p.
7) Оценка мощности и размер выборки
- Рекомендуется симуляционный power‑анализ на основе ожидаемой дисперсии и минимально важного эффекта. Примерная формула для двухгрупповой задачи (чтобы получить начальную оценку):
$$n=\frac{2{\sigma }^2(z_{1-\alpha /2}+z_{1-\beta }{)}^2}{{\Delta }^2}$$
где $\Delta$ — ожидаемая разность средних, ${\sigma }^2$ — дисперсия, $\alpha$ — уровень значимости, $\beta$ — вероятность II рода.
8) Проверки предположений и качества данных
- Диагностика остатков, гомоскедастичность, нормальность; проверка выбросов и влияющих наблюдений.
- Контроль целостности экспозиции (концентрация частиц во времени), подтверждение, что фактическое воздействие соответствует назначенному.
- Повторный анализ чувствительности: исключение/включение выбросов, альтернативные трансформации, разные модели.
9) Воспроизводимость и прозрачность
- Прописать SOP с деталями (частицы: источник, сушка, хранение; подготовка суспензии; методы подсчёта клеток; приборы и настройки).
- Независимые повторные запуски в разные дни/партии (блоки), и при возможности независимая репликация в другом лабораторном условии.
- Пред‑регистрация протокола или статистического плана; публиковать исходные данные и код анализа (R/Python), параметры и результаты model fits, raw time‑series.
- Включать QC‑площадки и отчёты по проверкам (контрольные образцы, blank samples).
10) Возможные систематические ошибки (важнейшие)
- Адсорбция/сорбция растворимых веществ на поверхности микропластика (псевтотоксичность через удаление питательных веществ).
- Ли‑чеаты или добавки в пластике, а не сами частицы.
- Аггрегация/оседание частиц — неравномерная экспозиция между репликами.
- Биофильм на частицах, который меняет доступность/влияние.
- Различия в размерах/форме/плотности частиц между партиями.
- Изменение физико‑химических параметров среды (pH, проводимость) вследствие частиц.
- Контаминация или перекрёстная трансмиссия между сосудами.
- Неправильная оценка начальной плотности клеток (конфондинг).
При проектировании и интерпретации нужно измерять или контролировать каждый из этих факторов.
11) Интерпретация причинно‑следственных выводов
- Сильные основания для причинности: рандомизация обработки, временная предшествующая связь (воздействие предшествует изменению), воспроизводимый дозо‑отклик, механистические данные (метаболиты, пути).
- Ограничения: лабораторные условия не полностью воспроизводят природную среду; наблюдаемые эффекты могут быть опосредованы (через изменение питательных веществ, микробных сообществ и т.д.), т.е. не обязательно чисто «частицы → прямой эффект».
- Рекомендуется осторожная формулировка: «рандомизированный эксперимент даёт сильные доказательства причинной связи между назначенной экспозицией и наблюдаемым исходом в условиях эксперимента; обобщение на природные экосистемы требует дополнительных подтверждений».
- Провести медиаторный анализ/механистические измерения для разделения прямого и опосредованного эффекта; выполнить sensitivity analysis на потенциальные неконтролируемые искажения.
Краткий чек‑лист действий перед стартом
- Провести пилот для оценки дисперсии и агрегации.
- Сделать power‑анализ (симуляционный).
- Сформулировать статистический план (модели, коррекции, критерии исключения).
- Подготовить SOP и план рандомизации/слепоты.
- Определить QC‑меры и метрики воспроизводимости.
Если нужно, могу: предложить пример R‑кода для LMM/ANOVA/Dunnett, шаблон power‑симуляции или форму pre‑registration.