Краткая рабочая гипотеза: накопление окисленных липидов (в т.ч. оксидированных кардиолипинов/PUFA) нарушает ОЭТ (особенно комплексы I/III), повышает митохондриальный ROS, нарушает митофагию/биогенез → уменьшение О2‑потребления и АТФ → мышечная слабость. Дальнейшие эксперименты должны: 1) подтвердить молекулярные мишени, 2) показать причинно-следственную связь, 3) протестировать вмешательства.
I. Исследования in vitro (порядок: диагностическое → функциональное → интервенционное)
- Материал: первичные миотубы/миобласты от пациента и контролей; iPSC‑дифференцированные миотубы; при необходимости мышечные волокна.
- Анализы окисления липидов и липидомика:
- LC‑MS/MS липидомика для идентификации и количественной оценки оксидированных липидов (кардиолипин, PE‑PUFA и т.д.).
- BODIPY 581/591 C11 флуоресценция и хроматография для уровня липидной пероксидации.
- Митохондриальная функция:
- OCR/ECAR (Seahorse) для базального и макс. дыхания, резервного дыхательного капацитета.
- Митохондр. мембранный потенциал (TMRM/JC‑1), ATP‑люцифераза, активность комплексов I–V спектрофотометрически/BN‑PAGE.
- MitoSOX для митохондр. супероксида.
- Структура и комплексы:
- EM для морфологии митохондрий; BN‑PAGE + western для суперкомплексов.
- Антиоксидантная система:
- Уровни GSH/GSSG, GPX4, SOD2, PRDXs; CoQ/убихинон.
- Митофагия/митохондриальный динамизм:
- mt‑Keima/LC3, Parkin recruitment, p62, OPA1/MFN2/DRP1 уровни.
- Генетика/транскрипт:
- WES/WGS и mtDNA секвенирование; RNA‑seq для путей ремоделирования липидов и стресса.
Интервенционные in vitro тесты (проверка причинности и лечения):
- Превенция липидной пероксидации:
- ферроптоз‑ингибиторы (ferrostatin‑1, liproxstatin‑1), липофильные антиоксиданты (vitE), митохондриальные антиоксиданты (MitoQ, MitoTEMPO, SkQ1). Сравнить восстановление OCR, ATP, Δψ, уровень липидной пероксидации.
- Генетические манипуляции:
- переброс (overexpression) GPX4, SOD2, ферментных регуляторов (ACSL4 KO/knockdown); CRISPR‑коррекция подозрительных мутаций в клетках пациента и введение мутаций в контрольные клетки (reciprocal experiments). Исследовать восстановление функции.
- Функциональная валидация:
- если специфические оксидированные липиды повышены (напр. оксидированный кардиолипин) — добавить синтетические оксидированные липиды в контроле, посмотреть, воспроизводят ли фенотип (падение OCR, Δψ).
- Контрольные условия и статистика:
- биологические реплики $n=3\text{–}6$, технические $n=3$; дозно‑временные кривые, блочные рандомизированные эксперименты.
Критерии причинности in vitro:
- фенотип пациента воспроизводится в контрольных клетках при добавлении оксидированных липидов или введении мутации;
- фенотип купируется при фармакологической/генетической блокаде липидной пероксидации или при коррекции мутации.
II. Исследования in vivo (порядок: модель → тестирование вмешательств)
- Модели:
- если найдена генетическая мутация: мышь с muscle‑specific knock‑in / knock‑out (AAV‑Cre, конститутивный или inducible).
- при отсутствии явной мутации: моделирование через диету (высокий PUFA), хроническое окислительное стрессирование (низкие дозы rotenone/antimycin) или комбинация с мышечно‑специфическим ослаблением GPX4/повышением ACSL4.
- Функциональные конечные точки:
- сила и выносливость: grip‑strength, rotarod, treadmill до отказа; дыхательная функция (VO2), мышечная масса.
- биопсии мышц для OCR, комплексов ОЭТ, EM, липидомика.
- in vivo ROS/пероксидация: mito‑roGFP/химические индикаторы, BODIPY‑C11 in situ.
- Интервенции терапевтического характера:
- фармакологические: ferrostatin‑1/liproxstatin‑1, MitoQ/MitoTEMPO, CoQ10, витE, LOX‑ингибиторы; тестировать монотерапию и комбинации.
- генетические/доставочные: AAV‑GPX4 или AAV‑SOD2, AAV‑PGC1α для повышения биогенеза; CRISPR‑редактирование для коррекции мутации.
- метаболические: NAD+ предшественники (NR, NMN), карнитин, стимуляторы митофагии (urolithin A), упражнения/имитаторы.
- Дизайн и контроль:
- группы $n=8\text{–}12$ животных/группа; слепая оценка, временные точки до/после лечения.
- исходные параметры: биохимия крови, кинетика лекарств (PK), токсичность.
Критерии причинности in vivo:
- модель воспроизводит клинический фенотип и биомаркеры (повышенные оксид. липиды, сниженный OCR);
- терапевтическая блокада пероксидации или генетическая коррекция восстанавливает функцию, силу и биохимические маркеры.
III. Приоритетные измеряемые исходы (быстрый чек‑лист)
- восстановление OCR/ATP на ≥$<$ заранее определённый порог (установить статистически);
- снижение уровня BODIPY‑C11 и специфических оксидированных липидов;
- улучшение силы/выносливости in vivo и нормализация морфологии митохондрий.
IV. Примечания по трансляции
- начинайте с patient‑derived клеток и in vitro rescue (быстрее, дешевле) → подтверждение в генетической модели → тестирование безопасности/PK перед in vivo терапевтическими испытаниями.
- комбинируйте антиоксидантную стратегию (мито‑таргетная) с модуляцией липидного метаболизма (ACSL4/LOX) и усилением митофагии/биогенеза.
Если нужно, могу привести конкретные протоколы (концентрации, сроки, наборы тестов) для каждого шага.