Коротко — какие структурные признаки определяют каталитическую активность и специфичность, и как мутации в активном центре меняют кинетику.
1) Структурные особенности, определяющие активность и специфичность
- Геометрия активного центра: форма и размер кармана связывания (S1, S2 …) ориентируют субстрат для реакции.
- Каталитические остатки: кислота/основание/нуклеофилы (например, Ser, His, Asp, Cys, Glu) напрямую участвуют в переносе протонов/электронов.
- Стабилизация переходного состояния: диполи, водородные связи, негидрофобные контакты и опосредованное взаимодействие через друг. структуры снижают $\Delta G^{‡}$.
- Электростатическое поле и pKa смещение: локальная среда смещает pKa каталитических остатков, делая их более/менее реакционноспособными.
- Ко‑ферменты и металлы: ионы/постоянно связанные группы (Fe, Zn, NAD+, PLP) участвуют в переносе электронов/групп.
- Динамика/индуцированный подгон (induced fit) и конформационные изменения: мобильность участков обеспечивает правильную ориентацию и исключение воды.
- Кинетические «карманы специфичности»: специфические контакты с боковыми цепями субстрата определяют селективность.
2) Как мутации в активном центре меняют кинетику (качественно и через параметры)
- Основные кинетические параметры: скорость по Михаэлису-Ментен
$v=\frac{V_{max}[S]}{K_M+[S]}$, где $V_{max}=k_{cat}[E{]}_T$.
Каталитическая эффективность — $\frac{k_{cat}}{K_M}$.
- Связь $K_M$ с элементарными константами (простая схема $E+S\stackrel{k_1}{\underset{k_{-1}}{\rightleftharpoons }}ES\stackrel{k_{cat}}{}E+P$):
$K_M=\frac{k_{-1}+k_{cat}}{k_1}$.
- Мутации могут влиять так:
- Снижение стабилизации переходного состояния $\Rightarrow$ увеличивается $\Delta G^{‡}$ и падает $k_{cat}$. По Эйрингу/Аррениусу:
$k=\kappa \frac{k_{B}T}{h}{e}^{-\Delta G^{‡}/RT}$, поэтому
$\frac{k_{mut}}{k_{wt}}=e^{-(\Delta \Delta G^{‡})/RT}.$ - Ослабление связывания субстрата (увеличение $K_d$ для ES) $\Rightarrow$ растёт $K_M$ (снижение сродства) и падает эффективность $k_{cat}/K_M$. Связь свободной энергии связывания:
$\Delta G_{bind}=RT\ln K_d.$ - Изменение $p{K}_a$ каталитического остатка (замена окружающих боковых цепей) может уменьшить или увеличить долю активной формы, влияя на $k_{cat}$.
- Стерическое препятствие или потеря координации металла: блокировка подхода субстрата или разрушение каталитического центра резко снижает $k_{cat}$ и/или увеличивает $K_M$.
- Изменение динамики/конформационных переходов: если мутация мешает индуцированному приему — снижается эффективный $k_1$ или увеличивается энергия активации, что опять же снижает $k_{cat}$ и/или повышает $K_M$.
3) Итог в одном предложении
Молекулярно-структурные признаки (геометрия кармана, каталитические остатки, электростатика, коферменты и динамика) определяют, как фермент стабилизирует переходное состояние и связывает субстрат; мутации в активном центре изменяют эти факторы, что выражается в изменениях $k_{cat}$, $K_M$ и эффективности $k_{cat}/K_M$ через сдвиги в $\Delta G^{‡}$ и $\Delta G_{bind}$.