Кейс: биохимический путь использует фермент A для превращения субстрата X в продукт Y; при введении ингибитора скорость падает, но Vmax остаётся прежним — какой тип ингибирования это указывает и как подтвердить экспериментально
Конкурентное ингибирование. Коротко почему: при конкурентном ингибировании максимальная скорость остаётся прежней, а кажущаяся константа Михаэлиса увеличивается. Модель и формулы: v=Vmax[S]Kmapp+[S]=Vmax[S]Km(1+[I]/Ki)+[S]v=\dfrac{V_{max}[S]}{K_m^{app}+[S]}=\dfrac{V_{max}[S]}{K_m(1+[I]/K_i)+[S]}v=Kmapp+[S]Vmax[S]=Km(1+[I]/Ki)+[S]Vmax[S], то есть Kmapp=Km(1+[I]Ki)K_m^{app}=K_m\bigl(1+\dfrac{[I]}{K_i}\bigr)Kmapp=Km(1+Ki[I]). Как подтвердить экспериментально (кратко и по шагам): 1. Измерить начальные скорости при нескольких концентрациях субстрата [S][S][S] (например ∼8 − 10\sim 8\!-\!10∼8−10 точек) при нескольких концентрациях ингибитора [I][I][I], включая [I]=0[I]=0[I]=0. Подогнать данные к уравнению Михаэлиса — ожидание: VmaxV_{max}Vmax практически не меняется, а KmappK_m^{app}Kmapp растёт с [I][I][I]. 2. Построить двойной обратный график (Lineweaver–Burk): 1/v1/v1/v против 1/[S]1/[S]1/[S]. Ожидаемый результат: линии для разных [I][I][I] пересекаются на оси ординат (тот же 1/Vmax1/V_{max}1/Vmax), наклон увеличивается. Уравнение: 1v=KmVmax(1+[I]Ki)1[S]+1Vmax. \dfrac{1}{v}=\dfrac{K_m}{V_{max}}\bigl(1+\dfrac{[I]}{K_i}\bigr)\dfrac{1}{[S]}+\dfrac{1}{V_{max}}.v1=VmaxKm(1+Ki[I])[S]1+Vmax1.
3. Оценить KiK_iKi: по зависимости наклона от [I][I][I] (наклон линейно зависит от [I][I][I]) или по Dixon‑плоту (1/v1/v1/v vs [I][I][I] при нескольких [S][S][S]) — пересечение даёт −Ki-K_i−Ki. 4. Функциональная проверка: при достаточном увеличении [S][S][S] ингибирование должно ослабевать и скорость стремиться к VmaxV_{max}Vmax. 5. Контроль: проверить обратимость ингибирования (разведение/диализ) и исключить альтернативные типы (неконкурентное — ↓VmaxV_{max}Vmax без изменения KmK_mKm; унконкурентное — ↓VmaxV_{max}Vmax и ↓KmK_mKm). Эти эксперименты однозначно подтвердят конкурентный механизм и позволят оценить KiK_iKi.
Коротко почему: при конкурентном ингибировании максимальная скорость остаётся прежней, а кажущаяся константа Михаэлиса увеличивается. Модель и формулы:
v=Vmax[S]Kmapp+[S]=Vmax[S]Km(1+[I]/Ki)+[S]v=\dfrac{V_{max}[S]}{K_m^{app}+[S]}=\dfrac{V_{max}[S]}{K_m(1+[I]/K_i)+[S]}v=Kmapp +[S]Vmax [S] =Km (1+[I]/Ki )+[S]Vmax [S] ,
то есть Kmapp=Km(1+[I]Ki)K_m^{app}=K_m\bigl(1+\dfrac{[I]}{K_i}\bigr)Kmapp =Km (1+Ki [I] ).
Как подтвердить экспериментально (кратко и по шагам):
1. Измерить начальные скорости при нескольких концентрациях субстрата [S][S][S] (например ∼8 − 10\sim 8\!-\!10∼8−10 точек) при нескольких концентрациях ингибитора [I][I][I], включая [I]=0[I]=0[I]=0. Подогнать данные к уравнению Михаэлиса — ожидание: VmaxV_{max}Vmax практически не меняется, а KmappK_m^{app}Kmapp растёт с [I][I][I].
2. Построить двойной обратный график (Lineweaver–Burk): 1/v1/v1/v против 1/[S]1/[S]1/[S]. Ожидаемый результат: линии для разных [I][I][I] пересекаются на оси ординат (тот же 1/Vmax1/V_{max}1/Vmax ), наклон увеличивается. Уравнение: 1v=KmVmax(1+[I]Ki)1[S]+1Vmax. \dfrac{1}{v}=\dfrac{K_m}{V_{max}}\bigl(1+\dfrac{[I]}{K_i}\bigr)\dfrac{1}{[S]}+\dfrac{1}{V_{max}}.v1 =Vmax Km (1+Ki [I] )[S]1 +Vmax 1 . 3. Оценить KiK_iKi : по зависимости наклона от [I][I][I] (наклон линейно зависит от [I][I][I]) или по Dixon‑плоту (1/v1/v1/v vs [I][I][I] при нескольких [S][S][S]) — пересечение даёт −Ki-K_i−Ki .
4. Функциональная проверка: при достаточном увеличении [S][S][S] ингибирование должно ослабевать и скорость стремиться к VmaxV_{max}Vmax .
5. Контроль: проверить обратимость ингибирования (разведение/диализ) и исключить альтернативные типы (неконкурентное — ↓VmaxV_{max}Vmax без изменения KmK_mKm ; унконкурентное — ↓VmaxV_{max}Vmax и ↓KmK_mKm ).
Эти эксперименты однозначно подтвердят конкурентный механизм и позволят оценить KiK_iKi .