План эксперимента (шаги) и оценка параметров Михаэлиса–Ментен:
1) Условия и подготовка
- Поддерживать постоянные $pH$, температуру и ионную силу (буфер), предварительно установить оптимальные для фермента.
- Концентрация фермента фиксирована и мала, чтобы обеспечить начальную кинетику (рекомендация: доля истощения субстрата в эксперименте $<10\%$). ($<10\%$ в KaTeX).
2) Подбор концентраций субстрата
- Использовать $8\text{–}12$ различных значений $[S]$, охватывающих диапазон ниже и выше $K_m$. Если $K_m$ неизвестен, взять логарифмически распределённый ряд, например $[S]=\{0.01,0.03,0.1,0.3,1,3,10\}$ (в соответствующих единицах) или диапазон $\sim 0.05-20\times$ предполагаемого $K_m$.
3) Проведение реакций и измерение начальных скоростей
- Для каждой $[S]$ запускать реакцию одинаковым способом (предварительный прогрев/прединкубация фермента и раствора), старт добавить субстрат и фиксировать накопление продукта или уменьшение субстрата.
- Снимать несколько ранних точек во времени и определять начальную скорость $v_0$ как наклон линейной регрессии концентрация продукта vs время на линейном участке. Ограничить время измерения так, чтобы израсходовано было $<10\%$ субстрата.
- Делать как минимум $n=2\text{-}3$ повторов для каждой $[S]$ и включать контроль без фермента (фон).
4) Обработка данных: аппроксимация Михаэлиса–Ментен
- Модель: $v=\frac{V_{\max }[S]}{K_m+[S]}$.
- Предпочтительный способ оценки: ненормированный нелинейный МНК (nonlinear least squares, e.g., Levenberg–Marquardt) подгонкой $v_0$ по $[S]$ для получения оценок $V_{\max }$ и $K_m$ и их доверительных интервалов. Нелинейная подгонка минимизирует смещение и не требует преобразований.
5) Альтернативные (линейные) преобразования — формулы и предупреждения
- Линеаризованные графики дают явные выражения, но склонны к искажению ошибок (особенно Lineweaver–Burk).
- Lineweaver–Burk: $\frac{1}{v}=\frac{K_m}{V_{\max }}\cdot \frac{1}{[S]}+\frac{1}{V_{\max }}$. Тогда
$V_{\max }=\frac{1}{\text{intercept}},K_m=\frac{\text{slope}}{\text{intercept}}.$ - Eadie–Hofstee: $v=-K_m\cdot \frac{v}{[S]}+V_{\max }$. Тогда
$K_m=-\text{slope},V_{\max }=\text{intercept}.$ - При использовании этих графиков применять взвешенную регрессию и проверять влияние отдельных точек.
6) Проверки качества модели и диагностика
- Построить остатки, оценить корреляцию параметров и доверительные интервалы.
- Проверить, достигается ли насыщение (асимптота $V_{\max }$). Если данные не показывают плато или возникла субстратная ингибиция/кооперативность, рассмотреть расширенные модели (субстратная ингибиция, Хилл и т.д.).
- При сомнениях повторить измерения с другим диапазоном $[S]$ или разными концентрациями фермента.
7) Отчёт и представление результатов
- Привести оценки $K_m$ и $V_{\max }$ с единицами и доверительными интервалами.
- Приложить график $v_0$ vs $[S]$ с аппроксимацией по Михаэлису–Ментен и график остатков.
Краткая сводка формул:
- ММ-скорость: $v=\frac{V_{\max }[S]}{K_m+[S]}$.
- Lineweaver–Burk: $\frac{1}{v}=\frac{K_m}{V_{\max }}\cdot \frac{1}{[S]}+\frac{1}{V_{\max }}$.
- Eadie–Hofstee: $v=-K_m\cdot \frac{v}{[S]}+V_{\max }$.
Это достаточный план для получения надежных оценок $K_m$ и $V_{\max }$.