Кратко — молекулярное объяснение и конкретный план эксперимента.
Молекулярные объяснения (выборка вероятных механизмов)
- Мутация вводит/удаляет ионизируемую группу (Asp/Glu/His/Lys/Arg), меняя локальные заряды и образование/разрушение солевых мостов → сдвиг pH‑зависимости стабильности.
- Мутация меняет среду вокруг ионизируемой группы (уплотнение упаковки или увлажнение), что изменяет её $p{K}_a$ и, следовательно, pH‑кривую стабильности.
- Мутация нарушает интерфейс винтовых спиралей (электростатическая комплементарность) и/или меняет кооперативность олигомеризации; при разных pH меняется доля олигомера/монемера.
- Мутация влияет на водородные связи/гидратацию, делая протонизацию более (или менее) дестабилизирующей.
Признаки для диагностики: роль His (чувствителен около $pH\sim 6$), сдвиг кривой стабильности по pH, зависимость от ионной силы, изменения в олигомерном состоянии.
Эксперимент для проверки (пошагово, с ожидаемыми результатами)
1) Конструирование белков:
- WT, мутант, «нейтральный» контроль (замена на Ala) и реверсия знака (например, если мутант заменил Glu→Lys — сделать Lys→Glu или Lys→Ala).
Цель: разобрать вклад заряда и упаковки.
2) Измерение стабильности как функция pH:
- Метод: CD (эллиптичность при $222$ nm) и/или хемически/термически индуцированная денатурация; альтернативно DSC для прямой термодинамики.
- Проводить при нескольких pH: $pH=5.0,6.0,7.0,8.0$ (и дополнительно вокруг ожидаемого $p{K}_a$).
- Из кривых получить $T_m$ и/или $\Delta G_{\text{fold}}$ при каждой pH; построить $\Delta G$ против pH.
Ожидаемый эффект: если протонизация дестабилизирует, $\Delta G$ будет уменьшаться при pH ниже $p{K}_a$ мутировавшей группы; разные варианты покажут, зависит ли эффект от заряда или от упаковки.
3) Оценить вклад протонизации количественно:
- Подход: модель «одной титруемой группы», доля протонированных $f=\frac{1}{1+10^{\mathrm{pH}-\mathrm{p}{K}_a}}$.
- Если протонизация меняет стабильность на $\Delta \Delta G$, то можно аппроксимировать
$\Delta G(\mathrm{pH})=\Delta G_{\text{deprot}}+f\cdot \Delta \Delta G$.
- Подгонкой данных получить $p{K}_a$ и $\Delta \Delta G$.
4) Непосредственное измерение $p{K}_a$ локальной группы:
- NMR‑титрация (сдвиги химических сдвигов по pH) для конкретных боковых цепей; или UV/флуоресцентная титрация, если есть подходящая метка.
Ожидаемый результат: сдвиг $p{K}_a$ у мутанта по сравнению с WT подтвердит изменение микроокружения.
5) Тест на электростатику и соль:
- Повторить измерения стабильности при разной ионной силе (например, $50$ mM и $300$ mM NaCl).
- Если эффект уменьшается при высокой ионной силе → электростатическая природа (солевые мосты/отталкивание).
6) Олигомеризация/интерфейс:
- Измерить молекулярную массу/олигомерное состояние vs pH (SEC‑MALS, аналитическое ультрацентрифугирование).
- Если изменение стабильности связано с диссоциацией комплекса, увидите изменение состояния сборки при тех же pH, где меняется стабильность.
7) Double‑mutant cycle (для пар взаимодействующих зарядов):
- Сделать двойную мутацию удаляющую предполагаемую пару и измерить $\Delta \Delta G$ связывания по формуле
$\Delta \Delta G_{\text{int}}=\Delta G_{AB}-\Delta G_A-\Delta G_B+\Delta G_{\text{WT}}$.
- Ненулевое $\Delta \Delta G_{\text{int}}$ укажет на специфическое взаимодействие (соль/пару).
Коротко об ожидаемых диагнозаx:
- Если дело в введённом His: сильный эффект вокруг $pH\sim 6$; NMR покажет $p{K}_a$ ~6 и модельная подгонка подтвердит вклад протонизации.
- Если удалён стабилизирующий Glu/Asp: потеря стабильности при pH, где партнёр несёт противоположный заряд; эффект частично нивелируется при высокой ионной силе.
- Если причина — упаковка/влага: $p{K}_a$ может смещаться значительно (вверх/вниз) и замены на Ala покажут схожий эффект.
Резюме (что делать первым делом)
- Сравнить WT и мутант по $\Delta G$ или $T_m$ при нескольких pH; затем NMR‑титрацию для локального $p{K}_a$ и тесты при разной ионной силе. Эти три шага обычно достаточно, чтобы определить, связана ли pH‑зависимость со сменой заряда/пары, изменением $p{K}_a$ или с нарушением интерфейса.