Ниже — компактный план возможных молекулярных механизмов, которыми мутация в гене саркомерного белка может нарушать сократительную функцию, и набор лабораторных экспериментов, которые позволят каждую гипотезу проверить. Я даю для каждой гипотезы: краткое описание механизма, ключевые эксперименты и ожидаемые результаты, которые бы её подтвердили.

Общие замечания

Не знаю, какой именно белок (миозин, актин, тропонин/тропомиозин, титан, небулин, MyBP-C и т. п.); многие эксперименты универсальны, часть — специфична для типа белка. Рекомендуемая последовательность: in silico → биохимия/биофизика in vitro → клеточные модели (пациентские клетки / iPSC-миоциты) → эксвиво (биопсия) → in vivo (животные). Контроля: WT белок / здоровые клетки, экспрессия мутационного и WT в одинаковых условиях, а также нокдаун/комплементация (rescue).

1) Нарушение взаимодействия тонкой/толстой нити (снижение силы на кросс‑мост)

Механизм: изменённая аффинность связывания (актин‑миозин или MyBP-C–миозин), уменьшение силы на одну головку, изменённый шаг/степень связывания.Эксперименты:
В in vitro motility assay (флуоресцентный актин на поверхности миозина) — скорость скольжения актиновых филаментов; изменение V означает изменение моторной функции.Молекулярные меры: ATPase-активность (миозиновая ATPase, Vmax, Km) — набор реактивов NADH-coupled или colorimetric.Optical trap / single molecule assay — сила шага и сила одиночной головки, частота событий.Co-sedimentation binding assay (миозин/актин) — коэффициент связывания.Ожидаемые результаты: сниженный V в motility, уменьшенный Vmax ATPase, сниженная сила в optical trap, пониженное связывание в co-sedimentation.

2) Изменение кинетики кросс‑мостов (ускорение/замедление циклов, изменённый ktr)

Механизм: мутация ускоряет/замедляет переходы в цикле ATP → изменённое время прикреплённого состояния (duty ratio), что влияет на силу и утомляемость.Эксперименты:
Skinned (раздеванные) мышечные волокна: измерение ktr (rate of force redevelopment) после быстрой релаксации/возврата; максимальное изометрическое напряжение.Стопп‑флоу и mant‑ATP для кинетики связывания/отщепления ATP.Синусоидальный анализ/Phasic stiffness для разделения механизмов.Ожидаемые результаты: отличия ktr, смещение кривых восстановления силы, изменение констант кинетики ATPase.

3) Изменение Ca2+-чувствительности регуляторного комплекса (особенно для тропонина/тропомиозина)

Механизм: мутация в регуляторных белках меняет pCa50 → миофибрилля реагирует на другой уровень Ca2+.Эксперименты:
Skinned fibers: измерение pCa–tension (pCa50, Hill‑коэффициент).Reconstituted thin filament assays (тропонин/тропомиозин с актином/миозином) в in vitro motility — посмотреть зависимость скорости/связывания от Ca2+.Ожидаемые результаты: сдвиг pCa50 в сторону большего/меньшего pCa (то есть повышенная/пониженная чувствительность), изменение крутизны кривой.

4) Неправильная сборка/интеграция саркомера (нарушение шикировки, разрывы Z‑диска)

Механизм: ошибки в сборке тонких/толстых нитей, нарушение соседних белковых взаимодействий (например, α‑актинин, nebulin, titin).Эксперименты:
Иммуногистохимия и конфокальная/суперрезолюционная микроскопия для локализации мутантного белка и структуры саркомера (зондами: α‑actinin, desmin, titin).Электронная микроскопия (темнопольная или TEM): ультраструктура саркомерной сетки.Солит‑/ко‑иммуноосаждение (co‑IP) и proximity labeling (BioID) для проверки утраты/ослабления взаимодействий.Ожидаемые результаты: разрыв регулярности саркомеров, смещение или отсутствие белка в ожидаемом локусе, потеря взаимодействий в co‑IP.

5) Снижение стабилизации/повышенное разложение белка (низкая стабильность, агрегаты)

Механизм: мутация делает белок нестабильным → протеасомная деградация, или наоборот → агрегация и токсичность.Эксперименты:
Western blot из биопсии/клеток (количество белка), pulse‑chase / cycloheximide chase для определения полужизни.Присоединение ингибиторов протеасомы/автофагии (MG132, bafilomycin) — посмотреть накопление.Filter‑trap assay или флюоресцентная микроскопия агрегатов, FRAP для динамики.Ubiquitination assay / mass‑spec для поиска меток деградации.Ожидаемые результаты: пониженный уровень при нормальной трансскрипции → ускоренная деградация; или наличие агрегатов и увеличенная ubiquitination.

6) Dominant‑negative vs haploinsufficiency

Механизм: мутантный белок мешает WT (dominant‑negative) или отсутствие функционального белка (haploinsufficiency).Эксперименты:
Экспрессия мутанта в WT-клетках/миоцитах (адвилирус/плазмида) и измерение функции (контрактильность, sarcomere integrity). Если мутант причиняет вред при наличии WT → dominant‑negative.Knockdown WT (siRNA) + rescue WT или mutant — посмотреть, восстанавливает ли WT функция.Allele‑specific qPCR / RNA‑seq для оценки экспрессии обоих аллелей.Ожидаемые результаты: ухудшение при добавлении мутанта к WT → dominant‑negative; восстановление при добавлении WT после knockdown → haploinsufficiency менее вероятна.

7) Нарушение механосенсинга и сигнальных путей (например, титан)

Механизм: мутация нарушает передачу механических сигналов, регуляцию рост/ремоделирования мышц.Эксперименты:
Анализ активности сигнальных путей (phospho‑Western: MAPK, Akt/mTOR) в ответ на нагрузку.Гены‑маркеры ремоделирования (qPCR).Функциональные тесты механической нагрузки in vitro (stretch of myotubes) и анализ ответа.Ожидаемые результаты: изменённая активация сигнальных каскадов после нагрузки.

8) Влияние на взаимодействие с регуляторными факторми (PTM, фосфорилирование)

Механизм: мутация изменяет сайты фосфорилирования/модификации или конформацию, влияя на регуляцию.Эксперименты:
Mass spectrometry для PTM‑профиля; phospho‑Western или фосфор‑протеомика.Mutagenesis: эмуляция/блокировка PTM (S->A, S->D) и проверка фенотипа.Ожидаемые результаты: потеря/изменение PTM, соответствующие функциональные изменения.

Практическая дорожная карта (рекомендованный порядок)

In silico:
Консервация аминокислот, прогнозы pathogenicity (PolyPhen, SIFT, REVEL), структурное моделирование (если структура известна) — предсказывают интерфейсы/стабильность.Пациентская биопсия:
Гистология (H&E), IHC, EM, Western blot — быстрый check‑list на агрегаты/локализацию/уровни.Биохимия/биофизика на рекомбинантном белке:
Bind/ATPase/motility/optical trap/структурные методы (cryo‑EM или кристалография, если возможно).Клеточные модели:
Пациентские клетки или iPSC‑дифференцированные миоциты/кардиомиоциты: контрактильность (микроскопия, traction force), Ca2+ imaging, rescue с WT протеином / CRISPR‑исправление.Эксперименты на мышечных волокнах:
Skinned fibers: pCa‑tension, ktr, максимальная сила, stiffness.In vivo:
Модель knock‑in/трангенная мышь — физиология, сила, поведение, ремоделирование.Rescue/терапевтическая проверка:
Генетическая коррекция, WT‑комплементация, малые молекулы (Ca‑sensitizers/inhibitors), chaperones.

Примеры конкретных техник/методов, которые часто дают решающий ответ

In vitro motility assay; NADH‑coupled ATPase; stopped‑flow/mant‑ATP; optical trap (single molecule force/step); co‑sedimentation; skinned fiber mechanics (pCa curves, ktr); confocal/super‑res microscopy; TEM; Western blot/pulse‑chase; iPSC‑derived cardiomyocyte/myotube контрактильность и Ca2+ transient; CRISPR knock‑in.

Если захотите, могу:

Подготовить более целевую панель экспериментов для конкретного белка (скажите, что за ген/мутация).Предложить условия опытов, набор необходимых контрольных образцов и примерные количественные критерии для «подтверждения» каждой гипотезы.