Кратко — механизм и практический план обнаружения/валидации.
1) Как комбинация мутаций и эпигенетики меняет экспрессию
- Мутации в промоторе могут: уничтожать/создавать сайты связывания транскрипционных факторов (ТФ), менять элементы ядра промотора (TATA, INR), вводить/удалять CpG‑диплеты или менять дистанцию между регуляторными мотивами. Это напрямую влияет на привлечение активаторов/репрессоров и инициацию транскрипции.
- Эпигенетические изменения (метилирование ДНК, модификации гистонов, изменение доступности хроматина) регулируют способность ТФ и полимеразы связываться с промотором: метилирование цитозинов и репрессивные гистоновые метки уменьшают экспрессию, ацетилирование и активирующие метки — повышают.
- Комбинация даёт синергию/потенцирование: например, мутация создаёт новый CpG, который становится метилирован и приводит к стабильному подавлению; либо мутация ослабляет связывание активатора, что приводит к локальной репрессии и набору репрессивных гистоновых меток. Возможны также аллельно‑специфические эффекты и влияние на взаимодействие с отдалёнными энхансерами через изменение конформации хроматина.
2) Методы для обнаружения (screening / кореляция)
- Последовательности: целенаправленное секвенирование промоторов или WGS/WES для выявления мутаций; глубокое таргетное ампликон‑секвенирование для низкочастотных/мозаичных вариантов.
- Метилирование ДНК: бисульфитное секвенирование (WGBS или RRBS) или таргетированное бисульфит‑ампликон‑seq; метилизационные чипы для большого числа образцов; oxBS/таблица для отличия 5‑гидроксиметилцитозина — если нужно.
- Хроматин/белки: ChIP‑seq или CUT&Tag/CUT&RUN для гистоновых меток и конкретных ТФ; ATAC‑seq или DNase‑seq для доступности хроматина.
- Функциональная корреляция: RNA‑seq для уровня экспрессии и для аллельно‑специфической экспрессии; eQTL/мета‑анализы если есть большие когорты.
- Пространственная организация: Hi‑C/4C/ChIA‑PET для контактов между промотором и энхансерами.
- Single‑cell методы (scRNA‑seq, scATAC‑seq, scBS‑seq или multi‑omics) при гетерогенных тканях.
3) Методы для валидации функционального эффекта
- Репортерные анализы: сравнить промотор WT vs мутация в люциферазных/GFP‑репортерах; можно in vitro метилировать промотор (например SssI) и сравнить влияние метилирования.
- Связывание белков: EMSA для проверки влияния варианта на связывание ТФ; ChIP‑qPCR/ChIP‑seq для проверки in vivo связывания ТФ и гистоновых меток.
- Редактирование генома: CRISPR/Cas9 или base/prime‑редактор для введения/исправления мутации в релевантных клетках; оценить экспрессию (qRT‑PCR, RNA‑seq) и фенотипы.
- Эпигенетическое редактирование: dCas9‑DNMT или dCas9‑TET для локального добавления/удаления метилирования и проверки эффекта на экспрессию.
- Доказательство причинности: rescue‑эксперименты (исправление мутации или деметилирование должно восстановить нормальную экспрессию/фенотип).
- Доп. методы: пиросеквенирование/таргетный бисульфит‑PCR для точной валидации метилирования; ddPCR или Sanger‑секвенирование для подтверждения мутации.
4) Практические замечания и контроль качества
- Использовать релевантный тип клеток/ткань и учесть тканеспецифичность регуляции.
- Контролировать конверсию бисульфита, технические реплики и независимые клоны при редактировании.
- Проверять аллельно‑специфические эффекты (фазировка варианта и экспрессии).
- Учитывать возможную роль соматических/мозаичных вариантов и необходимость глубокой секвенирования.
- Для 5‑гидроксиметилцитозина применять подходы, отличающие 5mC от 5hmC.
Краткий рабочий путь (рекомендация)
1) Обнаружение: секвенирование промотора + метилизационный профиль + RNA‑seq в парных образцах.
2) Приоритезация: анализ влияния на сайты ТФ, консервация, корреляция метилирование↔экспрессия, связь с фенотипом.
3) Функциональная валидация: репортеры, EMSA, ChIP, редактирование генома и эпигенетическое редактирование, rescue.
4) Репликация в независимых пациентах/моделях и статистическая проверка.
Если нужно, могу предложить конкретную панель методов и протоколы для вашего типа ткани/гена.