Причины снижения урожайности и способы устранения (коротко, с объяснениями).
1) Отток предшественников (углерода/азота/аминокислот)
- Механизм: синтетический путь «перетягивает» общие метаболиты (например, сахарозу, фосфосахара, триозы, аминокислоты), сокращая поток на рост/репродукцию.
- Диагностика: метаболомика, ${}^{13}$C-фаcинг, FBA.
- Исправление: усиление синтеза предшественников (оверэкспрессия ключевых энзимов), таргетирование пути в органеллу с собственным пулом (хлоропласт), понижение конкурирующих путей (CRISPRi/RNAi), обеспечить транспортеры для локализованного импорта субстратов.
2) Энергетическая и редоксная нагрузка (ATP/NAD(P)H)
- Механизм: синтез белка/метаболитов требует ATP/NADPH; дефицит уменьшает фотосинтез и рост.
- Диагностика: измерение соотношений NADPH/NADP${}^{+}$, ATP, фотохимические параметры.
- Исправление: усиление регенерации (например, оверэкспрессия G6PDH для NADPH), локализация пути в органеллы с избытком энергии (хлоропласт), понижение затрат на путь (замена ферментов на более энергоэффективные варианты).
3) Дефицит коферментов и специфичных метаболитов (например, S-аденозилметионин, UDP-глюкоза)
- Механизм: синтетический путь отбирает редкие коферменты → нарушение многих эндогенных реакций.
- Исправление: оверэкспрессия синтезирующих ферментов, введение альтернативных кофермент-зависимых ферментов, обеспечение транспорта коферментов.
4) Токсичность промежуточных продуктов или накопление конечных продуктов
- Механизм: накопление вредных метаболитов вызывает стресс, клеточную гибель, снижение деления.
- Диагностика: профиль токсичных метаболитов, стресс-маркеры.
- Исправление: добавить «ведущие» пути удаления/детоксикации, использовать эндоплазматическое ретикулум/вакуоль для секреции/изоляции продукта, уменьшить скорость образования токсичных промежуточных шагов (понизить экспрессию соответствующих ферментов).
5) Ошибочная локализация белков/путей (несоответствие компартментам)
- Механизм: ферменты вне нужной органеллы не получают субстраты/кофакторы или мешают ключевым процессам.
- Исправление: изменить сигнальные пептиды для таргетирования в хлоропласт, митохондрию, апопласт или вакуоль.
6) Протеостаз и нагрузка на трансляцию/фолдинг (ER-стресс, протеазная деградация)
- Механизм: высокоэкспрессированные белки вызывают ER-стресс, UPR, снижают рост; продукты подвергаются деградации.
- Исправление: снизить скорость синтеза (модификация промотора/UTR), соэкспрессировать шапероны/изоферменты, использовать секреторную таргетировку или мутировать сайты деградации.
7) Импакт на гормональный баланс и сигнальные сети (экологическая «переконфигурация»)
- Механизм: вмешательство в метаболизм меняет уровни ауксинов, цитокининов, этилена → изменяются деление/удлинение клеток.
- Исправление: минимизировать экспрессию в меристемах (использовать тканеспецифические промоторы), коррекция уровней гормонов (регуляция синтеза/катаболизма), выбирать промоторы, не действующие в критичных тканях.
8) Генетические побочные эффекты (вставка гена, влияние на соседние гены)
- Механизм: вставка трансгена разрушила или модифицировала эндогенные важные гены.
- Диагностика: секвенирование места вставки, экспрессомика.
- Исправление: пересоздать линию с другой вставкой/использовать безопасные сайты интеграции, CRISPR-целенаправленные вставки.
9) Конкуренция за азот/аминокислоты (при синтезе белковой вакцины)
- Механизм: большая доля доступного азота уходит на рекомбинантный белок.
- Исправление: экспрессия в тканях-накопителях (семена), inducible-системы (выражение после роста), увеличение азотного усвоения (оверэкспрессия транспортёров аминокислот/нитратредуктаз).
10) Регуляторная несовместимость (постоянная высокая экспрессия вместо inducible/tissue-specific)
- Исправление: заменить конститутивные промоторы на тканеспецифические или индуцируемые (температура, химический индуктор), употреблять слабые/умеренные промоторы или регуляторные элементы для балансировки.
Практическая стратегия устранения (пошагово)
1. Диагностика: метаболомика, транскриптомика, профили ATP/NADPH, ${}^{13}$C-флюкс-анализ.
2. Моделирование: составить отзывчивую модель баланса потоков $F_g+F_p=F_{total}$ и оптимизировать $F_p$ без критичного снижения $F_g$.
3. Инженерия: таргетирование, баланс экспрессии (промоторы/UTR/копии), коэкспрессия регенераторов коферментов и шаперонов, удаление конкурирующих путей.
4. Контроль: использовать индуцируемые/тканеспецифические системы или выражение в репродуктивных тканях (семена) для минимизации эффекта на вегетативный рост.
5. Отбор: селекция линий с минимальным фитнес-пенальти за счёт позиционного эффекта/копийности.
6. Агрономия: временно увеличить питание/свет/азот при отладке, но затем стремиться к генетическим решениям.
Коротко: основные причины — отток ресурсов, энергет/редокс дефицит, токсичность, неправильная локализация и регуляция; решения — баланс экспрессии, таргетинг в подходящие органеллы, усиление регенерации предшественников/коферментов, ткане- или индуктивный контроль и селекция линий после диагностики с помощью омics и моделирования.