Кратко — возможные механизмы, какие тесты/контроли делать и как интерпретировать данные для различения апоптоза, некроза и первичной митохондриальной дисфункции.
1) Процессы, которые могут объяснить снижение митохондриального мембранного потенциала и рост ROS
- Отключение окислительного фосфорилирования (uncoupling) — падение $\Delta {\Psi }_m$, повышенная потребность в кислороде; при сильном uncoupling ATP падает.
- Блокада электрон-транспортной цепи (особенно комплекс I или III) — накопление электронов и образование супероксида (ROS) при одновременном снижении $\Delta {\Psi }_m$. Примеры: ротенон (I), антимицин A (III).
- Открытие митохондриального переходного порта проницаемости (mPTP) — резкое падение $\Delta {\Psi }_m$, выброс Ca${}^{2+}$, ROS-усиление, возможна последующая потеря целостности мембраны.
- Повреждение митохондриальной ДНК/белков — хроническая дисфункция комплексов, повышенные ROS и сниженный $\Delta {\Psi }_m$.
- Промежуточные формы клеточной гибели: при апоптозе часто раннее частичное снижение $\Delta {\Psi }_m$ и ROS как сигнал; при некрозе — быстрый коллапс $\Delta {\Psi }_m$ вследствие энергетического истощения и сильный ROS.
2) Какие дополнительные тесты и контролы провести (ключевые, компактно)
- Измерение $\Delta {\Psi }_m$: JC-1 (соотношение агрегат/мономер), TMRE/TMRM (поток/микроскопия). Контроль: FCCP \( (\)разрушитель \(\Delta\Psi_m\)) как положительный контроль, напр. FCCP \(1\text{–}5\ \mu\mathrm{M}\).
- ROS: MitoSOX (митохондриальный супероксид), DHE или CM‑H2DCFDA (цитозольный ROS). Контроль: Antimycin A $1\mu \mathrm{M}$ для повышения митохондриального ROS.
- Жизнеспособность/целевая мембранная целостность: Annexin V / PI (поток), LDH-ремиссия (сывороточный LDH).
- Апоптоз-маркеры: активность каспаз $3/7$ (люминесцентный/флуоресцентный тест), PARP-кливаж (Westen blot), цитохром c в цитозоле (фракционирование + WB). Положительный контроль апоптоза: стауроспорин $1\mu \mathrm{M}$.
- Некроз: быстрый рост PI+/LDH и резкое падение $\mathrm{ATP}$ (люциферазный тест). Для индуцирования некроза: H${}_2$O${}_2$ $100\text{–}500\mu \mathrm{M}$ или термический шок.
- Метаболика/функция ОФ: кислородопотребление (Seahorse) — базальное дыхание, ATP-linked respiration, maximal respiration, spare respiratory capacity. Ожидаем: при первичной МД — снижение OCR и запаса; при uncoupling — повышение OCR с падением $\Delta {\Psi }_m$.
- Комплекс‑специфические активности: измерение активности комплексов I–IV (биохимические тесты).
- mPTP: ингибитор циклоcпорина A (CsA) — если восстановление $\Delta {\Psi }_m$ и снижение гибели при CsA, то вовлечён mPTP.
- Рескью/модификаторы: антиоксиданты (N‑ацетилцистеин, MitoTEMPO); пан-касапазный ингибитор zVAD‑fmk; если NAC/MitoTEMPO уменьшают гибель — ROS причинно значимы; если zVAD спасает — каспазы важны.
- Морфология митохондрий: конфокальная микроскопия (Mitotracker), TEM — фрагментация/набухание.
- Митофагия/митохондриальный контроль качества: PINK1, Parkin транслокация, LC3, p62.
Обязательные экспериментальные элементы: временная кинетика и дозовая кривая, реплики, вестерн/поток в тех же образцах, отрицательный (vehicle) и положительные контроли.
3) Как интерпретировать результаты для различения апоптоза, некроза и митохондриальной дисфункции — краткая «сводка паттернов»
- Апоптоз (митохондриально-опосредованный)
Ожидаемый набор результатов:
- частичное раннее снижение $\Delta {\Psi }_m$ (JC-1: увеличение мономера/уменьшение агрегата),
- выход цитохром c в цитозоль, активация каспаз $3/7$ и PARP-кливаж,
- Annexin V$+$/PI$-$ на ранней стадии, позднее Annexin V$+$/PI$+$,
- $\mathrm{ATP}$ может оставаться относительно сохранённым на ранних этапах,
- zVAD‑fmk уменьшает клеточную гибель; антиоксиданты могут частично уменьшать ROS, но ключ — каспазы.
Интерпретация: классический программируемый путь с MOMP.
- Некроз (регулируемый или неконтролируемый)
Ожидаемый набор:
- быстрый резкий коллапс $\Delta {\Psi }_m$, массовое повышение PI и LDH-выброс,
- резкое падение $\mathrm{ATP}$, отсутствие/слабая активация каспаз, отсутствие классического PARP-кливаж;
- zVAD не спасает; антиоксиданты могут уменьшить часть повреждения, но основное — энергетический коллапс.
Интерпретация: потеря мембранной целостности/энергетики — некротическая гибель.
- Первичная митохондриальная дисфункция (без немедленной гибели)
Ожидаемый набор:
- устойчивое снижение $\Delta {\Psi }_m$ и повышенный mito‑ROS (MitoSOX),
- снижение OCR (базальное и запас), уменьшенная активность комплексов I/III, снижение $\mathrm{ATP}$ при сильном дефекте,
- отсутствие явных маркеров апоптоза (нет значимой каспазной активации/цитохром c) и мембранной потери (Annexin V/PI отриц.),
- митофагия/повышение PINK1/Parkin возможны как адаптивная реакция; антиоксиданты/репарирующие вмешательства частично восстанавливают функцию.
Интерпретация: дефект ОФ/ЭТП как первичная причина; при нарастании тяжести может перейти в апоптоз или некроз.
4) Практическая схема проверки (коротко)
- Сразу: измерьте $\Delta {\Psi }_m$ (TMRE) + MitoSOX + Annexin V/PI + $\mathrm{ATP}$ + LDH — для первичной классификации.
- По результатам: если Annexin V+/касаза+: апоптоз — подтвердить цитохром c и zVAD; если PI+/LDH↑ и ATP↓: некроз; если только $\Delta {\Psi }_m$↓ и OCR↓ без апоптоза/некроза — первичная митохондриальная дисфункция — сделать комплекс‑ассеи и пробу с антиоксидантами/CsA.
- Всегда включать положительные контроли: стауроспорин (апоптоз), антимицин/FCCP (митохондрия), H${}_2$O${}_2$ (оксидативный некроз).
Если нужно, могу предложить конкретную последовательность экспериментов с объёмами/временными точками для вашей клеточной линии.