Краткий план эксперимента CRISPR/Cas для нокаута гена, повышающего засухоустойчивость (пример цели: ген деградации АБК, например CYP707A).
1) Выбор стратегии редактирования и доставки
- Стратегия: нокаут через инделы, вызываемые NHEJ (frameshift) в ранней экзонной области целевого гена.
- Система редактирования: высокоточная нуклеаза (например SpCas9-HF1 или eSpCas9) или Cas9 RNP для минимизации времени экспрессии.
- Доставка: для дикотов — Agrobacterium-mediated T-DNA (если приемлема интеграция); для производства трансген‑свободных линий — доставка Cas9 RNP в проtoplasts/изолированные эмбрионы через PEG или particle bombardment; для монокотов — biolistics с RNP или трансформацией культуры-эмбрионов.
- Дизайн gRNA: выбрать ≥2 независимых gRNA против экзонов 1–2; оценить off‑target in silico (CRISPOR/CHOPCHOP) и выбрать с наименьшим потенциальным off‑target.
2) Контрольные группы
- дикого типа (WT).
- пустой вектор / Cas9 без gRNA (если использовалась интеграция).
- нецелевой gRNA (scramble) — контроль на эффект от экспрессии комплекса.
- несколько независимых редактированных событий (минимум $3\text{–}6$ независимых линий).
- комплементация: восстановление функции через трансгенный WT‑алель (rescue) для подтверждения причинно‑следственной связи.
- нулевые‑сегреганты (если использовалась T‑DNA) — растения без вставки, но с наследованным нокаутом или наоборот (для выделения трансген‑свободных линий).
3) Валидация нокаута на молекулярном уровне
- первичный генотип: PCR ампликон целевой области + Sanger sequencing; анализ инделей (TIDE/ICE).
- глубокая ампликон‑секвенирование для количественной картины инделей (целевые сайты).
- RT‑qPCR для уровня транскрипта (проверка NMD или снижения экспрессии).
- белковая валидация (Western blot/LC–MS) при наличии антител.
- подтвердить отсутствие T‑DNA/плазмидного бэкенда (PCR по векторным участкам) для линий, претендующих на трансген‑свободу.
4) Валидация фенотипа (засухоустойчивость)
- контролируемые испытания: вертицально — рост в горшках с контролем почвенной влажности, фиксированные циклы засухи/восстановления; поле — многолетние испытания.
- метрики: выживаемость при засухе, относительная влажность тканей (RWC), массовая потеря стома́тной проводимости (gs), скорость фотосинтеза (A), урожайность/биомасса, летальность.
- физиология и биохимия: уровень ABA (LC–MS), осмотические потенциалы, корневая система (корневой индекс).
- дизайн эксперимента: рандомизированный блоковый дизайн с репликацией, например $n=8$ растений на генотип на условие; проводить минимум $3$ независимых эксперимента.
5) Оценка внецелевых (off‑target) эффектов
- in silico подбор и исключение сайтов с высоким сходством.
- ограничение экспрессии/Cas9 времени: использование RNP или промоторов с короткой/ткани-специфичной экспрессией.
- эмпирические методы: ампликон‑секвенирование предсказанных off‑target сайтов; GUIDE‑seq / SITE‑seq / Digenome‑seq (при возможности) для выявления неожиданных разрезов; для финальных линий — WGS для поиска непредвиденных SNV/инделов.
- фенотипическая и метаболомная проверка (untargeted metabolomics, трансриптомика) для обнаружения непреднамеренных эффектов.
6) Контроль качества и статистика
- анализ различий через ANOVA/GLM, множественные сравнения с поправкой (например, Tukey); порог значимости $p<0.05$.
- учитывать эффекты линии и эффект места/поля; репликация по времени/лоти.
7) Экологические риски при выпуске трансформатов и меры смягчения
- риски: горизонтальное распространение аллеля через пыльцу/семена в дикие родственники (gene flow); повышение конкурентоспособности => инвазивность; изменение водного баланса в экосистеме; влияние на опылителей/микробиоту/трофические сети; непреднамеренные фитотоксические или аллогенные эффекты; возможные плейотропные потери урожайности.
- смягчение: предварительные гибридизационные тесты с местными видами; использование стерильности/контейментных линий; генетические барьеры (хлоропластная трансформация для снижения передачи через пыльцу, если применимо); буферные зоны и полевые барьеры; поэтапные полевые испытания и мониторинг распространения семян/волонтеров; полевые испытания в изолированных площадках; долгосрочный мониторинг экосистемных параметров.
- регуляторные требования: экологическая оценка риска, оценка непреднамеренных эффектов, общественно‑правовые согласования и планы по откату/утилизации при обнаружении нежелательных эффектов.
8) Резюме практических чисел/параметров
- использовать минимум $2$ независимых gRNA; подтвердить минимум $3$ независимых успешных событий; репликация фенотипа $n=8$ (или больше) на условия; статистический порог $p<0.05$.
Этот план обеспечивает: минимизацию внецелевых эффектов (RNP + высокоточная Cas9), строгие контролы (WT, пустой вектор, комплементация), молекулярную и фенотипическую валидацию и список обязательных мер по оценке и снижению экологических рисков перед выпуском.