Кратко — определения:
- Синонимичная мутация: замена нуклеотида, не меняющая кодируемой аминокислоты (также «tRNA‑кодифер»).
- Нонсинoнимная (замещающая) мутация: меняет аминокислоту в полипептиде.
1) Влияние на структуру и функцию белка
- Нонсинoнимные:
- Прямое изменение первичной структуры: может нарушать гидрофобность, заряд, размер, H‑связи, сайты катализа/связи, места ПТМ → меняет конформационную стабильность, кинетику, аффинность, агрегацию.
- Частые механизмы: потеря функции (наличие в активном центре), частичная дисфункция, неустойчивость (белок быстро деградируется), незначительные или адаптивные изменения.
- Синонимичные:
- Не меняют аминокислоту, но влияют косвенно: скорость и точность трансляции, ко‑трансляционная укладка, стабилизация/дестабилизация матРНК, сплайсинг (если в экзонно‑интегральных сигналах), сайты miRNA/регуляторные мотивы, уровни локализации и ПТМ косвенно.
- Результат: изменения экспрессии, соотношения изоформ, неправильная укладка при сборке — могут приводить к функциональным дефектам сопоставимым с нонсинoнимными.
2) Роль в эволюции
- Нонсинoнимные подвержены отбору: консервативные сайты — сильный отрицательный отбор; адаптивные изменения — положительный отбор.
- Стандартная метрика: $\mathrm{dN}/\mathrm{dS}$ (или ${\mathrm{K}}_{\mathrm{a}}/{\mathrm{K}}_{\mathrm{s}}$). Интерпретация: $\mathrm{dN}/\mathrm{dS}<1$ — отрицательный отбор, $\mathrm{dN}/\mathrm{dS}\approx 1$ — нейтрально, $\mathrm{dN}/\mathrm{dS}>1$ — положительный отбор.
- Синонимичные обычно считались нейтральными, но сейчас ясно, что они могут быть объектом селекции (кодоновая оптимальность, регуляция экспрессии, поддержание mRNA‑структуры). Таким образом, часть синонимичных изменений — не нейтральна и участвует в адаптации и сохранении регуляторных свойств.
3) In silico предсказание (основные инструменты и подходы)
- Для нонсинoнимных:
- Консервация/эволюционные: SIFT, MutationAssessor.
- Функция/структура: PolyPhen‑2, PROVEAN.
- Энергетика и стабильность: FoldX, Rosetta, DynaMut (предсказывают $\Delta \Delta G$ при замене).
- Интегративные ML: CADD, REVEL, PrimateAI.
- Молекулярное моделирование/MD: оценка конформационных изменений и динамики.
- Для синонимичных:
- Сплайсинг: SpliceAI, MaxEntScan — предсказывают нарушение сайтов сплайсинга.
- mRNA‑структура и стабильность: RNAfold, mFold — изменение локальной ΔG структуры.
- Кодоновая оптимальность/скорость трансляции: CAI (Codon Adaptation Index), tAI (tRNA adaptation index), инструменты, использующие ribosome profiling данные.
- miRNA/регуляторные сайты: miRanda, TargetScan.
- Современные ML‑методы для регуляторного эффекта (часто интегрируют эпигенетические/транскриптомные данные).
- Ограничения in silico: предсказания вероятностны, чувствительны к входным данным (структура, выровненная последовательность), не учитывают все клеточные контексты.
4) In vitro / in vivo эксперименты
- Нонсинoнимные — функциональные тесты:
- Энзимные/биохимические: измерение активности, K${}_{\mathrm{m}}$, V${}_{\max }$.
- Связывание: SPR, ITC, коиммунопреципитация.
- Стабильность/укладка: DSC, термальный разворот (Tm), circular dichroism, протеазная чувствительность.
- Клеточные фенотипы: комплементация, локализация (флуороформы), деградация (CHX‑chase).
- Синонимичные — фокус на транскрипт/трансляцию:
- Репортерные конструкции (luciferase/флуоресценция) с заменой кодона → измерение экспрессии и эффективности трансляции.
- qPCR и измерение mRNA half‑life (ActD chase) — стабильность мРНК.
- Полисомный профильинг и ribosome profiling — изменение плотности рибосом/скорости трансляции.
- Сплайсинг‑ассеи (minigene) — проверка активации/понижения сайтов.
- Протеомика/Western — уровни белка и ПТМ.
- Масштабные методы:
- Deep mutational scanning (DMS): библиотека вариантов + селекция/секвенирование → профиль функции для тысяч мутаций (и синонимичных).
- Массивные reporter‑screens интегрируют эффекты на экспрессию и функцию одновременно.
- Контекст важен: in vitro биохимия даёт молекулярный механизм; клеточные/организменные ассэйсы — физиологическую релевантность.
5) Практические рекомендации
- Для нонсинoнимных: начать с консервации и структурных предсказаний (SIFT/PolyPhen, FoldX), затем подтвердить биохимическими тестами и/или DMS при возможности.
- Для синонимичных: проверять влияние на сплайсинг (SpliceAI), mRNA‑структуру (RNAfold), CAI/tAI; при подозрении — reporter assays, ribosome profiling, полисомы и измерение mRNA half‑life.
- Комбинируйте in silico и эксперимент: предсказания дают гипотезы, DMS и целевые in vitro/в vivo эксперименты — верификацию.
Краткий итог: нонсинoнимные мутации обычно влияют напрямую на структуру/функцию белка и подлежат сильному отбору; синонимичные чаще действуют косвенно (транскрипт/трансляция/сплайсинг) и тоже могут быть функционально значимыми. Надёжная оценка требует сочетания предсказаний (консервация, структурные/регуляторные модели) и экспериментальной валидации (биохимия, ribo‑profiling, DMS, репортеры).