Кратко — сначала про механизмы, затем конкретные изменения дизайна.
Молекулярные механизмы, объясняющие много сшивок (indels) и вставок
- Классическая неточной репарации двойного разрыва (c‑NHEJ): белки Ku70/Ku80, DNA‑Ligase IV быстро захватывают концы и соединяют их с удалением/дописыванием нуклеотидов — даёт случайные делеции и короткие вставки.
- Микрохомологичная энд‑склейка / TMEJ (polymerase θ‑зависимая): использует короткие микро‑гомологии ($\sim 5\text{–}25$ нт) → характерны делеции с микрохомологией и иногда шаблонные вставки (templated insertions).
- Полимеризаторное «fill‑in» и нефункциональное выравнивание концов — частые короткие вставки ($1\text{–}10$ нт).
- Захват экзогенной ДНК (плазмидные фрагменты, интеграция донорного шаблона) — приводит к непредсказуемым вставкам.
- Низкая активность HDR в растительных соматических клетках (HDR активна в фазах S/G2), поэтому репарация DSB преимущественно идёт по NHEJ/TMEJ → мало точных замен.
Как изменить дизайн/процедуру для получения точных замен (рекомендации)
1. Избежать DSB или минимизировать NHEJ
- Использовать без‑DSB методы: базовые редакторы (base editors) для замены отдельных нуклеотидов; prime editing для точных замен/инсерций без классических DSB.
2. Способ доставки и форма донорного шаблона
- Для мелких точечных замен/коррекций: ssODN длиной с плечами гомологии $\sim 40\text{–}80$ нт по каждой стороне.
- Для крупных вставок: двухцепочечный донор с длинными плечами гомологии $\sim 0.5\text{–}1.0$ кб.
- Использовать вирусные/репликативные векторы (geminivirus replicons) для увеличения копий донорного шаблона в клетке.
- Транспорт RNP (кешированная Cas9/sgRNA) вместо плазмид для уменьшения случайной интеграции векторного ДНК.
3. Повысить HDR‑активность / направить репарацию в S/G2
- Синхронизация/обогащение клеток в фазах $S/G2$ (или использовать регуляторы клеточного цикла).
- Сопровождение экспрессией факторов рекомбинации (RAD51, BRCA1/2), или фьюз Cas9 с CtIP/BRCA‑мотивами для увеличения рестрикции концов и стимуляции HDR.
- Тетрамификация донорного шаблона к Cas9 (tethering) для локального увеличения концентрации шаблона у разрыва.
4. Подавление конкурентных путей (NHEJ / TMEJ)
- Временное подавление/мутирование ключевых компонентов NHEJ (KU70/KU80, Lig4) или TMEJ (polymerase θ, PolQ) повышает долю HDR; в растениях показано, что подавление PolQ увеличивает точные вставки. Учтите возможные эффекты на фитнес и геномную стабильность.
- Химические ингибиторы (напр., SCR7 для Lig4) дают противоречивые результаты в растениях; использовать осторожно.
5. Использовать альтернативные разрезы/нуклеазы
- Cas12a даёт смещённые (sticky) концы — иногда меняет профиль репарации.
- Paired nickases (двойной nick) снижают частоту NHEJ‑indel и могут повысить HDR.
6. Дизайн sgRNA и донорных плеч
- Выбирать мишени с минимальным риском образования нестабильных концов и с учётом окружающих микрогомологий (чтобы не стимулировать MMEJ).
- Для MMEJ‑зависимой предсказуемой вставки использовать целенаправленные микро‑гомологии (PITCh подход) — если хотите предсказуемую, но MMEJ‑опосредованную интеграцию.
7. Технические меры снижения нежелательных вставок
- Минимизировать присутствие линейной/кусочной плазмидной ДНК (и векторных остатков) в трансформационном материале.
- Проводить трансформацию с меньшим временем экспрессии Cas9 (транситные RNP) для уменьшения числа случайных событий.
8. Практические рекомендации по выбору стратегии
- Если цель — одна точечная замена → сначала пробовать base editor (если замена возможна) или prime editor.
- Если цель — небольшая точная вставка/замена ($\le 100$ п.н.) → ssODN + nickase или prime editing.
- Для больших точных вставок ($>1$ кб) → длительные плечи гомологии + geminivirus replicon/транзиторное подавление Lig4/PolQ, либо использовать сортировку/отбор по маркеру и последующее удаление маркера.
Кратко вывод: профиль с высокой долей сшивок/вставок — типичное следствие доминирования NHEJ/TMEJ и низкой HDR в растительных клетках. Для точных замен либо избегают DSB (base/prime editors), либо целенаправленно усиливают HDR и подавляют NHEJ/TMEJ, а также оптимизируют форму и доставку донорного шаблона.