План проверки (приоритеты) и гипотезы — кратко, по шагам:
1) Немедленные меры
- Карантин: прекратить использование линии, пометить, изолировать культуру.
- Сохранить образцы: морозильные аликвоты текущей культуры и среды.
- Фотодокументация морфологии и микроскопия (фазовый контраст).
2) Быстрая первичная диагностика (в течение $24$–$72$ часов)
- Осмотреть среду: помутнение, пленки, осадок, изменение цвета индикатора pH.
- Живая/мертвая оценка: Trypan blue или автоматический счетчик (вилки).
- Микроскопия на наличие бактерий/дрожжей/грибов, клеточных включений, синцитиального эффекта.
- Gram-окраска/прямая микроскопия осадка среды.
- Посев среды на бактериальные и грибковые агар-пластины; 16S rRNA PCR для бактерий, ITS PCR для грибов/дрожжей.
- Тест на микоплазму: PCR-метод или флуоресцентное окрашивание (DAPI/Hoechst); культивирование на SP4 по возможности.
- Проверка pH, глюкозы, лактата, осмолярности среды.
3) Среднесрочные тесты (обычно $3$–$7$ дней)
- STR-аутентификация (чтобы исключить перекрестную контаминацию или подмену линии).
- Кариотипирование или массив CNV/low-pass WGS — для хромосомной нестабильности.
- Тесты на вирусы (qPCR/ELISA) — в зависимости от вида клетки: e.g. CMV/EBV/adenovirus для человек. При подозрении на вирусный CPE — вирусный скрининг.
- LAL-тест на эндотоксин и проверка сыворотки/реагентов (тестируем запасные порции).
- Посев контрольного флакона из оригинального криостока (если есть) параллельно.
4) Функциональные и патофизиологические проверки
- Апоптоз/некроз (Annexin V/PI), активность каспаз.
- Клеточный цикл (PI/BrdU/EdU) — выявить блокирование деления.
- Сенесценция (SA-β-gal).
- Экспрессия ключевых маркеров/транскриптов (qPCR/вестерн) — для потери фенотипа/дифференцировки.
- Тесты на метаболизм (OCR/ECAR) при необходимости.
5) Проверка условий и реагентов
- Контроль инкубатора: температура, CO${}_2$, влажность; целостность термостата.
- Проверка лотов сыворотки, среды, трипсина, антибиотиков — параллельные культуры с запасным лотом/без антибиотиков.
- Оценить частоту и длительность оттаивания/пассирования (переэксплуатация, высокий пассажный номер).
6) Гипотезы и характерные признаки
- Острый бактериальный/грибковый патоген: быстрая потеря контаминации, помутнение среды, видимые клетки/колонии, рост погибающих клеток.
- Микоплазма: постепенное замедление роста, аномальная морфология без явной помутнности, искажение ответов на препараты — подтвердить PCR/флюоресценцией.
- Вирусная инфекция: цитопатический эффект (синцитии, вакуолизация), положительные вирусные PCR/ELISA.
- Перекрестная контаминация/смена линии: внезапная смена морфологии + STR-несовпадение.
- Генетическая нестабильность/дрейф: постепенные изменения, аутентификация совпадает, но кариотип/array показывает аномалии.
- Сенесценция/дифференцировка: рост замедлен, SA-β-gal+, изменение маркеров дифференцировки.
- Проблемы среды/реагентов/инфубатора: изменение pH, низкая глюкоза, высокий лактат, перебои по температуре/CO${}_2$.
7) Действия после идентификации причины
- Бактерии/грибы/вирусы: утилизировать культуру, стерилизовать оборудование; при вирусе — оповестить биобезопасность.
- Микоплазма: при ценной линии — лечение Plasmocin/типа, но предпочтительно восстановить чистый банк; иначе утилизировать.
- Перекрестная контаминация или генетический дрейф: восстановить из аутентифицированного раннего криостока; пересев/клонирование при необходимости.
- Проблемы с реагентами/инкубатором: заменить партию реагентов, провести чистку/калибровку оборудования.
8) Профилактика
- Регулярный тест на микоплазму ($ежеквартально$ или перед ключевыми экспериментами).
- STR-аутентификация при заведении линии и периодически.
- Ведение четкого реестра пассажа и контролей, ограничение использования антибиотиков.
Краткая схема по времени: немедленно — карантин, фотодокументация, микроскопия, pH/видимые признаки; $24$–$72$ ч — посевы, PCR на микоплазму/бактерии/грибы, тесты реагентов; $3$–$7$ дн — STR, кариотип/генетические тесты, функциональные ассеи.