Коротко и по существу — набор экспериментальных подходов и примерный порядок действий для идентификации и характеристики ранее неизвестного микроорганизма из почвы.
1. Подготовка и предварительная обработка образца
- Просеивание, удаление крупных частиц, суспендирование в буфере, серийные разведения (например, $10^{-1}$, $10^{-2}$, $10^{-3}$).
- Контроль контаминации и использование отрицательных контролей.
2. Микроскопия и окраски
- Световая микроскопия: морфология клетки (палочки, кокки, спирали).
- Окраска по Граму (Gram) — базовая классификация.
- Флуоресцентная микроскопия/DAPI для подсчёта клеток.
- Электронная микроскопия (SEM/TEM) — ультраструктура.
3. Классические культурные методы
- Посев на разнообразные среды (непосредственно богатые и селективные) — попытка выделить в чистую культуру.
- Изменение условий роста: температура (например, $4-37^{\circ }\mathrm{C}$), рН, аэробность/анаэробность, солёность.
- Обогащение по предполагаемой метаболической особенности (C-, N-источники).
4. Морфология колоний и физиологические тесты
- Описание колоний (цвет, форма, текстура).
- Биохимические тесты: каталаза, оксидаза, сахарная ферментация, ферментативные тесты (API, VITEK).
- Профили роста по pH, температуре, солености; устойчивость к антибиотикам.
5. Мас-спектрометрия (MALDI-TOF MS)
- Быстрая идентификация по белковому «отпечатку» при наличии библиотек; полезна для известных видов.
6. Молекулярная идентификация (ключевой этап)
- Экстракция ДНК из изолята (и/или прям из образца).
- Амплификация и секвенирование гена $16S$-рРНК (бактерии) или ITS (грибы) — первая таксономическая привязка.
- Пороговые значения: сходство $16S$ > $97\%$ обычно указывает на род, > $98.7\%$–$99\%$ — возможный тот же вид (но требует подтверждения).
- Если культивируем, секвенирование полной геномной ДНК (WGS) для точной идентификации и анализа функций.
7. Геномный анализ
- Сборка и аннотация генома; расчет ANI (average nucleotide identity) — граница вида примерно $95\%-96\%$.
- Поиск генов метаболизма, патогенности, антибиотикорезистентности, плазмидов.
8. Метагеномика / ампликонный секвенинг (если культивирование не удалось)
- Ампликонный $16S$/ITS-секвенинг для определения состава сообщества.
- Шотган-метагеномика для получения генетической информации о ненастолько упорядоченных микроорганизмах и функций.
9. Функциональные и физиологические характеристики
- Подтверждение метаболических путей: тесты на использование субстратов (Biolog), дыхательные/ферментативные профили.
- Стабильный изотопный трекинг (SIP) для установления участия в переработке конкретных субстратов.
- Измерение продукции метаболитов (GC–MS, LC–MS), токсинов, ферментов.
10. Протеомика и транскриптомика
- MS-протеомика для подтверждения белковых наборов.
- RNA-seq для оценки экспрессии генов при разных условиях.
11. Альтернативные подходы для некультивируемых клеток
- Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) для локализации и идентификации в матрице почвы.
- Одноклеточная геномика (single-cell genomics) — секвенирование изолированных клеток.
- Культуру-независимые методы (целевые гены, qPCR) для оценки распространённости/абунданса.
12. Таксономическое оформление (при обнаружении нового вида)
- Комплекс фенотипических, генетических и биохимических данных.
- Сравнение с типовыми штаммами; публикация описания по правилам (если новый вид).
Рекомендованный рабочий порядок (кратко): микроскопия + Gram → попытки культивирования при разных условиях → молекулярная идентификация ($16S$/ITS) → при удаче — WGS и фенотипирование → функциональные тесты (метаболизм, ферменты, устойчивость).