Кратко — причины можно разделить на технические (ошибки метода) и биологические (свойства гена/организма). Для каждого приведу типичный признак и простой способ отличить.
Технические причины и как проверить
- Офф‑таргеты (непреднамеренные разрезы в других локусах). Признак: разные неожиданные фенотипы у независимых линий; мутации не связаны с локусом мишени. Проверка: секвенирование предсказанных офф‑таргет сайтов или ампликон‑deep‑seq; при необходимости WGS.
- Мозаицизм / соматические правки (редактирование после нескольких делений эмбриона). Признак: фенотипы непостоянны между особями, разные ткани содержат разные аллели. Проверка: секвенирование отдельных особей/ткани; генотипирование головы/крыльев и т.д.
- NHEJ‑инделы вместо точного HDR (создание неожиданных рамочных сдвигов/трансляционных стопов). Признак: небольшой индель в целевом экзоне; фенотип жёсткий при гомозиготе. Проверка: ампликон‑секвенирование таргета.
- Крупные делеции/рекомбинации/инверсии в целевом регионе. Признак: невозможность амплифицировать ожидаемый фрагмент; потеря соседних генов. Проверка: длинный‑рид секвенирование, PCR «через» участок, Southern blot.
- Интеграция плазмидного бэкбона/вектора/маркерного кассетного фрагмента в геном. Признак: неожиданная последовательность в локусе; маркерный фенотип (например, mini‑white). Проверка: PCR на junctions, inverse/splinkerette PCR, WGS.
- Ошибки дизайна sgRNA (снижение специфичности или низкая активность). Признак: слабая эффективность HDR или множественные некорректные события. Проверка: in‑silico анализ офф‑таргетов, тесты альтернативных gRNA.
- Токсичность Cas9 или процедура инъекции (повреждение эмбрионов). Признак: высокая смертность/неспецифические морфологические дефекты и у контролей. Проверка: контрольные инъекции (Cas9 без gRNA, gRNA без Cas9).
Биологические причины и как проверить
- Плейотропия гена (один ген — несколько функций). Признак: несколько независимых фенотипов, соответствующих разным ролям гена. Проверка: литературная аннотация; резюкция (rescue) с тканеспецифичным промотором.
- Гаплоинсуффицит или доминантно‑отрицательные аллели (неожиданно сильный/альтернативный фенотип у гетерозигот). Признак: фенотип у гетерозигот; различие между null и мутантным аллелем. Проверка: комплементация с нуль‑аллелем; сравнение с точным нокаутом.
- Модификаторы/генетический фон. Признак: фенотипы меняются после скрещивания с другой линией. Проверка: сериальное выведение в чистый фон (backcross); если фенотип уходит — фон.
- Материнский/отцовский эффект (материнский белок/мРНК влияет на эмбрион). Признак: фенотип зависит от направления скрещивания. Проверка: реверсивные скрещивания (mutant ♀ × WT ♂ и наоборот).
- Транспозоны или активация мобильноcти ДНК (редактирование/стресс может активировать элементы). Признак: разнородные мутации, изменения экспрессии. Проверка: RNA‑seq, WGS на мобильные элементы.
- Позиционный эффект трансгенов/инсертов (искусственный промотор/маркер влияет на соседние гены). Признак: фенотипы зависят от места интеграции. Проверка: определение места вставки (splinkerette PCR или WGS); сравнение нескольких независимых интеграций.
Как отличать на практике — рекомендуемая диагностика (короткая пошаговая)
1. Генотипирование таргета: ампликон‑Sanger или deep‑seq у нескольких особей и тканей (проверить инделы, HDR, делеции).
2. Независимые аллели: получить ≥2 независимые линии (разные gRNA/события). Если фенотип повторяется — скорее он‑таргет.
3. Рескью: вернуть WT‑копию гена (транзгеном) — устранение фенотипа подтверждает on‑target.
4. Outcross / backcross: убрать фон; если фенотип уходит — фоновые мутации/модификаторы.
5. Проверка офф‑таргетов: секвенирование предсказанных сайтов; при сомнении — WGS (короткий рид) или long‑read для структурных вариантов.
6. Проверка на интеграцию вектора/структурные изменения: junction‑PCR, splinkerette PCR, long‑read WGS.
7. Функциональные тесты: qRT‑PCR/Western для экспрессии, комплементация с дефицитом/нулевой аллелью, тканеспецифические рескью.
Если нужно, могу дать упорядоченный контроль‑лист с конкретными примерами PCR‑мишеней и приоритетом тестов для дрозофилы.