Кратко — последовательность и какие методы применять, с пояснениями:
- $(1)$ In silico (низкая стоимость, быстро даёт гипотезы):
- гомология: BLAST, HMMER, Pfam/InterPro;
- домены, мотивы, сайт катализа; предсказание TM-спиралей (TMHMM), сигнальных пептидов (SignalP), локализации;
- структурное моделирование (AlphaFold) и сопоставление с известными структурамми.
- Цель: получить рабочие гипотезы (фермент/транспорт/регулятор/структурный белок).
- $(2)$ Экспрессия и стабильность белка:
- клонирование в экспрессирующий вектор, SDS‑PAGE, Western blot; проверка растворимости/получаемости.
- Рationale: понять, можно ли получить белок для дальнейших опытов.
- $(3)$ Локализация в клетке:
- фьюжн с флуоресцентным или эпито́п‑тегом (GFP, 3×FLAG) + флуор. микроскопия;
- клеточное фракционирование (цитозоль/мембрана/периплазма) и протеазная защита.
- Цель: выяснить компартмент — даёт сильные подсказки о функции.
- $(4)$ Взаимодействия (картирование партнёров):
- AP‑MS (аффинная очистка + MS), кросслинкинг‑MS, ко‑иммунопреципитация, бактериальный двух‑гибрид (BACTH).
- Рationale: связывание с известными белками указывает на путь/комплекс.
- $(5)$ Генетические методы — потеря и усиление функции:
- делетирование гена/CRISPRi/условные мутанты; фенотипирование при разных условиях (темп., pH, стресс, субстраты, антибиотики);
- транзитонная секвенция (Tn‑seq) для выявления условной важности; комплементация мутанта.
- Цель: установить, при каких условиях белок важен и какие процессы затрагиваются.
- $(6)$ Специфические биохимические тесты (по гипотезам):
- для ферментов — субстратные/коферментные тесты, кинетика (Km, Vmax) — например измерение активности по изменению поглощения или HPLC;
- для ДНК/РНК‑связывающих — EMSA, footprinting, in vitro транскрипция/репрессия;
- для транспортёров — реассемблирование в липосомы и измерение транспорта; для связывания лигандов — ITC/SPR/флуоресцентные титрации.
- Рationale: подтвердить предполагаемую молекулярную функцию.
- $(7)$ Системная биология (если надо — для контекста):
- метаболомика (LC‑MS), транскриптомика (RNA‑seq), протеомика — сравнение WT vs мутант;
- генетические взаимодействия (synthetic sick/lethal screens).
- Цель: показать влияние на метаболические пути/сети.
- $(8)$ Структурная биология и детальная механистика:
- кристаллография, cryo‑EM, NMR; мутгенез остовных остатков и кинетика.
- Рationale: понять механизм на атомном уровне и подтвердить каталитические остатки.
Рекомендации по порядку: начать с $(1)$ in silico + параллельно $(2)$ экспрессия; затем $(3)$ локализация и $(4)$ взаимодействия; на их основе спланировать целевые $(5)$ генетические тесты и $(6)$ биохимические эксперименты; при необходимости расширить до $(7)$ системных и $(8)$ структурных исследований. Параллелизация некоторых этапов ускорит выводы и снизит риск ложных гипотез.