Краткий план исследования клеточных и молекулярных механизмов дефицита памяти при KO гена, связанного с синапсами.
1) Подтверждение фенотипа и временной параметр:
- Поведенческая батарея: контекстуальное обучение/страх (fear conditioning), Моррис/пространственная память, объектное распознавание; сравнение KO vs WT, слепой анализ, когорты $n=8\text{–}12$ на группу.
- Определить возраст начала дефицита (развитие vs взрослые): тесты в возраста́х $P21$, $P60$, $P180$.
2) Синаптическая физиология (приоритет):
- Полевая запись LTP/LTD в CA1 (вызвать штыревой потенциал и измерять fEPSP): тестировать индукцию LTP (theta-burst, HFS) и LTD. Ожидаемые показатели: уменьшенная величина LTP в KO.
- Целевые whole-cell patch: измерить mEPSC/mIPSC (частота и амплитуда), AMPA/NMDA-отношение, paired-pulse ratio (PPR). Интерпретация: снижение частоты mEPSC → потеря/ослабление пресинаптических входов; снижение амплитуды mEPSC или AMPA/NMDA → постсинаптические нарушения; изменение PPR → изменение вероятности высвобождения.
3) Структурная морфология синапсов:
- Конфокальная/двухфотонная микроскопия и анализ дендритных шипиков (щетинистость, плотность, форма) в пирамидальных нейронах; Golgi-окрашивание; выбор $n=6\text{–}10$ животных.
- Электронная микроскопия (EM) для размеров синаптической щели, постсинаптической плотности (PSD) и числа активных зон.
4) Биохимия и молекулярная характеристика:
- Вестерн/иммуноколокация: уровни синапс. белков (PSD-95, Synapsin, Bassoon, GluA1/GluA2, NR1/NR2), фосфорилирование (например GluA1-S845).
- Поверхностная биотинилизация рецепторов AMPAR/NMDAR для оценки внешней экспрессии.
- Co-immunoprecipitation / proximity ligation: искать взаимодействия KO-белка с ключевыми синаптическими партнёрами.
- Анализ синаптической везикулярной динамики: FM1-43 или pHluorin-метки для контроля отщепления/рециркуляции.
5) Транскриптомика / протеомика:
- Региональный bulk RNA-seq (гиппокамп, префронталка) и/или single-cell RNA-seq для выявления изменённых путей (синаптическая передача, цитоскелет, синаптогенез).
- Мас-спектрометрия протеома/фосфопротеома для поиска изменённых сигналинг-сетей.
6) Клеточная специфичность и время действия:
- Условный (cell-type specific) KO или восстановление экспрессии через AAV в конкретных типах (например CA1 пирамидальные vs интернейроны), чтобы определить, в каких клетках функция критична.
- Индуцируемый (tamoxifen- CreER) KO у взрослых, чтобы отличить роль в развитии от роли в поддержании.
7) Функциональные и поведенческие резкью/модификации:
- Рескью: вирусная повторная экспрессия WT-гена в поражённой области — восстановление поведения и синаптической физиологии подтверждает причинность.
- Мутанты: экспрессировать варианты (например без домена взаимодействия) для картирования функциональных доменов.
- Фармакологические/опто/хемогенетические вмешательства: стимулировать активность (chemogenetics DREADDs, optogenetics) или усиливать пластичность (forskolin, ampakines) и смотреть на восстановление LTP/памяти.
8) Интерпретация результатов (основные сценарии):
- mEPSC частота ↓, PPR изменён → преимущественно пресинаптическая дисфункция (меньше синаптических контактов или снижена вероятность высвобождения).
- mEPSC амплитуда ↓, AMPA/NMDA ↓, снижение surface-AMPAR, уменьшение PSD-95/спайнов → постсинаптическая дефектность (рецепторный траффик, PSD-организация).
- LTP ↓ при нормальном базальном синапс. трансмиссии → специфический дефект механизма пластичности (сигнальные каскады, фосфорилирование).
- Транскриптомные и протеомные изменения укажут на вторичные компартменты (цитоскелет, протеазомная деградация и т.д.).
9) Контроли и статистика:
- Литтер-матчи, слепой анализ, валидация рескью-конструкций. Типичные размеры групп $n=6\text{–}12$ для физиологии/морфологии; порог значимости $p<0.05$ (коррекция для множественных сравнений при необходимости).
Приоритет: (1) подтвердить поведенческий фенотип и время его возникновения; (2) электрофизиология (mEPSC, PPR, LTP); (3) морфология/EM; (4) биохимия и рескью; (5) транскриптомика/протеомика; (6) клеточная и временная специфика. Это позволит установить, какой уровень (пресинаптический/постсинаптический/пластичности/развития) ответственен за дефицит памяти и какие молекулярные пути его опосредуют.