Кратко: разнонаправленное поведение (часть клеток умирает апоптозом, часть выживает) обычно определяется балансом между проапоптотическими и просурвивал-сигналами, уровнем вариабельности (стохастикой) и динамикой сигналинга. Ниже — ключевые пути, механизмы разнообразия и практические эксперименты для выяснения причин.
1) Ключевые внутриклеточные пути и узлы (что измерять/помечать)
- Экзогенный (рецептор‑зависимый) апоптоз: death‑receptors (Fas, TNFR1), формирование DISC → каспаза‑8 → каспаза‑3. Метки: активная каспаза‑8, каспаза‑3/7, экспрессия c‑FLIP, уровни рецептора.
- Митохондриальный (внутренний) путь: Bcl‑2 family (Bax/Bak vs Bcl‑2/Bcl‑XL/Mcl‑1) → MOMP → цитохром c → апоптосом → каспаза‑9 → каспазы‑3. Метки: MOMP (TMRM/JC‑1), цитохром c в цитозоле, Bax активный, уровни Bcl‑2/Mcl‑1.
- Ингибирующие апоптоз белки: IAP (XIAP) — метка XIAP, Smac.
- Про‑выживальные пути: PI3K–Akt (фосфор‑Akt), MAPK/ERK (pERK), NF‑κB (nuclear p65) — помечать фосфостатусы/локализацию.
- Пересечения/кроссток: каспаза‑8 кливит Bid → tBid (связывает митохондр. путь), NF‑κB индуцирует c‑IAP и Bcl‑2, JNK может усиливать апоптоз.
2) Причины разнонаправленного ответа (вариабельность)
- Нон‑генетическая гетерогенность: различия в уровнях белков (рецепторы, Bcl‑2, c‑FLIP, XIAP), фазe клеточного цикла, митохондриальном состоянии, метаболизме.
- Сигнальная динамика: пульс/постоянство сигнала (например, кратковременный vs устойчивый NF‑κB или ERK) задаёт судьбу.
- Стохастика биохимических реакций и пороговые/бистабильные свойства сети (решающие узлы с положительной обратной связью).
- Микроокружение: градиенты лиганда, контакты, факторы роста.
3) Как это изучить — методы и дизайн эксперимента
- Одноклеточные методы (обязательно): time‑lapse живой микроскопии с репортерами апоптоза (субстраты для каспаз, Annexin V/GFP‑caspase FRET), сенсоры MOMP (Smac/cytochrome c GFP), флуоресцентные биопрнсаторы Akt/ERK/NF‑κB (FRET или nuclear translocation).
- Одно‑клеточный анализ в популяции: flow‑cytometry (Annexin V/PI, активные каспазы, pAkt/pERK), mass cytometry (CyTOF) для множественных маркеров, single‑cell RNA‑seq/proteomics для выявления предикторов.
- Перспективный кореляционный подход: измерить набор предикторов в каждой клетке ДО стимуляции (рецептор, Bcl‑2, размер, фаза цикла), затем следить за судьбой — оценить, какие факторы предсказывают смерть/выживание (логистическая регрессия, случайный лес).
- Пертурбации для проверки причинности: ингибиторы/активаторы (zVAD‑fmk — pan‑caspase inhibitor; BH3‑миметики — ABT‑199 для Bcl‑2; PI3K/Akt inhibitors, MEK inhibitors, IKK/NF‑κB inhibitors), siRNA/CRISPR‑KO/overexpression (c‑FLIP, Bcl‑2, XIAP, Bid). Ожидаемый эффект показывает вклад узла.
- Дозо‑ и временные эксперименты: меняйте концентрацию и продолжительность лиганда, чтобы увидеть сдвиг фракции выживших; измеряйте динамику ранних сигнальных ответов и связывайте с конечной судьбой.
- Биохимия: иммуноблот для кливеных каспаз/партий Bcl‑2, ко‑иммуноосаждение DISC, измерение цитохром c.
4) Анализ и моделирование
- Модели детерминированные ODE для ключевых компонентов + стохастические симуляции (Gillespie) для объяснения вариабельности.
- Бистабильность/пороговый анализ: искать пороговые концентрации про‑/антиапоптотических белков; пример логистической кривой для вероятности смерти:
$P_{death}(I)=\frac{1}{1+\exp (-k(I-I_0))}$ где $I$ — интегральный показатель сигнала (напр., интеграл pERK или pAkt), $I_0$ — порог.
- Регрессии/машинное обучение на одноклеточных данных для предикторов судьбы.
5) Практическая схема эксперимента (рекомендуемая)
- 1) Выбрать репортеры: caspase sensor, MOMP dye, pAkt/pERK reporters.
- 2) Снимки до стимуляции (предикторы), затем добавление лиганда и time‑lapse 24–48 ч.
- 3) Классификация клеток по судьбе (умер/выжил) и корреляция с предикторами.
- 4) Пертурбации ключевых узлов (ингибиторы, KO/overexp) для теста гипотезы.
- 5) Моделирование для объяснения порогов и предсказания комбинаций вмешательств.
Коротко: ищите баланс Bcl‑2 family vs проапоптотические сигналы, активность каспаз, роль NF‑κB/PI3K–Akt/ERK, измеряйте на уровне отдельных клеток (динамика) и тестируйте причинность с помощью пертурбаций и моделирования.