Кратко — принцип и практические модификации.
1) Принцип цепной полимеризации (PCR)
- Задача: экспоненциально умножить специфичный фрагмент ДНК.
- Компоненты: матричная ДНК, два праймера (Forward/Reverse), дезоксинуклеотидтрифосфаты (dNTP), буфер с Mg^{2+}, термостабильная ДНК‑полимераза (напр. Taq).
- Циклы стадий (повторяются $N$ раз, обычно $25\text{–}40$ циклов):
- денатурация при $\sim 95^{\circ }\mathrm{C}$ — разделение цепей;
- отжиг праймеров при $\sim 50\text{–}65^{\circ }\mathrm{C}$ — специфическое связывание праймеров;
- синтез при $\sim 68\text{–}72^{\circ }\mathrm{C}$ — удлинение цепей полимеразой.
- Кинетика (идеал): при полном удвоении на каждый цикл количество молекул:
$$N=N_0\cdot 2^n,$$ где $N_0$ — начальное число копий, $n$ — число циклов. При неполной эффективности:
$$N=N_0(1+E{)}^n,$$ где $E$ — эффективность (0–1).
2) Ограничения и ключевые проблемы
- неспецифичность и праймер‑димеры; ингибиторы из образцов; ограничение чувствительности и точности абсолютного счета; риск контаминации ампликонами.
3) Модификации и расширение применения
- Обратная транскрипция PCR (RT‑PCR)
- для РНК: сначала c помощью обратной транскриптазы синтезируют кДНК, затем PCR. Применяется для диагностики РНК‑вирусов и анализа экспрессии генов.
- Количественный (реального времени) PCR — qPCR
- регистрация сигнала во время амплификации через флуоресцентные красители (SYBR Green) или меченые зонды (TaqMan, molecular beacons).
- Позволяет получать относительную и относительную/абсолютную количественную информацию через пороговое значение цикла (Cq/Ct). При идеальной эффективности изменение одного цикла соответствует двукратному изменению:
$$\frac{N_{0,1}}{N_{0,2}}=2^{-\Delta \mathrm{Cq}}$$ - Используется для вирусной нагрузки, экспрессии генов, количественного мониторинга.
- Цифровой PCR (dPCR, включая ddPCR)
- дробление реакции на множество независимых секций/капель, статистический подсчёт положительных секций и оценка с использованием пуассоновской статистики:
$$\lambda =-\ln \left(1-\frac{k}{n}\right),$$ где $k$ — число положительных разделов, $n$ — общее число разделов; концентрация = $\lambda$ на объём раздела.
- Даёт абсолютную количественную оценку без калибровочных кривых, высокая чувствительность к редким мутантам.
- Мультиплекс PCR
- одновременное амплифицирование нескольких мишеней в одной реакции (разные праймеры/зонды) — ускоряет диагностику (панели патогенов, мутаций).
- Нестед (nested) и полу‑нестед PCR
- два последовательных раунда с внутренними праймерами для повышения специфичности и чувствительности.
- Hot‑start, touch‑down, оптимизированные режимы
- hot‑start (полимераза активируется при нагреве) уменьшает неспецифическую лигирование; touch‑down снижает неселективное связывание при начале реакции.
- Долговременный (long‑range) PCR
- специализированные полимеразы и условия для амплификации длинных фрагментов (килобазы).
- Isothermal методы (альтернативы PCR, расширяющие POC)
- LAMP, RPA и др. работают при постоянной температуре (нет термоциклинга), подходят для быстрых маркеров на месте исследования; часто сочетаются с визуальной или флуоресцентной детекцией.
- Хотя технически это не PCR, они расширяют применение там, где нужен простой и быстрый POC‑тест.
- Интеграции с CRISPR‑диагностикой
- SHERLOCK/DETECTR: предварительная изотермическая амплификация + CRISPR‑зависимая детекция (высокая специфичность и чувствительность).
- Микрофлюидика и автоматизация
- портативные и быстрые аппараты, «sample‑to‑answer» карманы и штативы для POC и high‑throughput.
4) Практические применения в диагностике и исследованиях
- клиническая диагностика патогенов (вирусы, бактерии, паразиты);
- мониторинг вирусной нагрузки и терапевтический контроль;
- обнаружение онкогенных мутаций, минимальной остаточной болезни, детекция редких аллелей (dPCR);
- скрининг наследственных заболеваний и неинвазивная пренатальная диагностика;
- исследования экспрессии генов (RT‑qPCR), single‑cell анализы (после обратной транскрипции и амплификации);
- судебная генетика, экология и мониторинг окружающей среды, метагеномика (амплификон‑библиотеки).
5) Качество и контроль
- использование контролей (позитивных/негативных), праймер‑веб‑проектирование, предотвращение перекрёстной контаминации (dUTP/UNG), валидация эффективности и диапазонов динамики.
Вывод: классический PCR — простая и мощная технология экспоненциального умножения ДНК; её модификации (RT‑PCR, qPCR, dPCR, мультиплекс, изотермические методы, интеграции с CRISPR и микрофлюидикой) значительно расширили диагностические и научные возможности по чувствительности, количественности, скорости и удобству применения.