Кратко — набор приоритетных экспериментов, как выяснить механизм деградации пластика и оценить потенциал для биоремонта. Разбит по блокам: что делать, как измерять, какие данные получить.
1) Быстрая фенотипическая характеристика (первичный скрининг)
- Изоляция штаммов/консорциума (разделение на твердых средах, отбор по росту на пластике как единственном источнике C/N).
- Ростовые тесты: культура в минимальной среде с кусочком/порошком полимера; сравнение со стерильным контролем. Число повторов ≥3.
- Оценки деградации:
- Потеря массы: измерять $m_0$ и $m_t$; $\%\text{mass loss}=\frac{m_0-m_t}{m_0}\times 100\%$.
- Минерализация (CO${}_2$) в закрытой системе или респиометр: $\%\text{mineralization}=\frac{C{O}_{2,sample}-C{O}_{2,control}}{TotalCinpolymer}\times 100\%$. По возможности использовать изотопно меченый полимер (${}^{13}C$ или ${}^{14}C$) для точной минерализации.
- Контролы: стерильный, убитый (автоклав), без микроорганизмов.
2) Химические и физические доказательства разложения (какое именно изменение полимера)
- SEM/TEM — визуализация поверхности (трещины, борозды).
- FTIR, Raman, XPS — изменения химических групп на поверхности (карбоксильные, гидроксильные и др.).
- GPC/SEC — изменение молекулярной массы/полидисперсности.
- GC-MS / LC-MS / NMR — идентификация растворимых мономеров/диеров (катаболиты). Это покажет гидролитический/оксидативный механизм.
- Измерение гидрофобности поверхности (контактный угол).
3) Биохимия и идентификация ферментов
- Экстракция секретома / супернатанта; zymography на субстратах (полиэфиры, полиуретаны и т.д.) для обнаружения активных зон.
- Очистка белков, определение активности; кинетика: измерять $v$ при разных $[S]$ и аппроксимировать Майкла — Ментона: $v=\frac{V_{max}[S]}{K_M+[S]}$. Определить $K_M$, $V_{max}$, специфическую активность (например, $\mu \text{mol}{\text{min}}^{-1}{\text{mg}}^{-1}$).
- Тесты чувствительности к температуре, pH, соли (оптимумы и стабильноcть).
- Ингибиторы/редокс-реакции для различения гидролитических и окислительных ферментов.
4) Молекулярные и омics-исследования (механизм и гены)
- Метагеномика / геномика изолята: поиск известных мотивов (PETase, MHETase, липазы, эстеразы, пероксидазы, лигазы).
- Метatranscriptomics / протеомика супержидкости или пластиночного биопленка — какие гены экспрессируются в присутствии полимера.
- Клонирование и гетерологичная экспрессия кандидатов; проверка активности рекомбинантных белков.
- Генетические валидации: нокаут/комплементация (если возможно) для связи гена с фенотипом.
5) Механизмы (гипотезы и тесты)
- Гидролиз vs окисление: поиск малых кислородсодержащих продуктов, проверка зависимости от O${}_2$, добавление редокс-буферов; измерение H${}_2$O${}_2$ и других окислителей.
- Адгезия и биопленки: тесты на образование биопленок, влияние модификации поверхности.
- Последовательность деградации: идентификация промежуточных продуктов во времени (таймпоинты).
6) Оценка экологического потенциала и эффективности в естественных условиях
- Микрокосмы (почва) и мезокосмы: добавление пластика в почву с исходной микробиотой, сравнение биоаугментации (добавление штамма) vs биостимуляции (питательные добавки).
- Колонки с почвой (вертикальная миграция), различные температуры/влажности.
- Параметры: процент минерализации за фиксированный срок, скорость потери массы (например, $\text{mg polymer}\cdot {\text{g}}^{-1}\cdot {\text{d}}^{-1}$), изменения физического состояния.
- Экотоксичность продуктов деградации: тесты на колонии растений, дрожжей, Daphnia, цитотоксичность.
7) Масштабирование и инжиниринг
- Тесты с очищенными ферментами: реакторы (пакетные/проточныe), иммобилизация ферментов.
- Биопроцесс: определение устойчивости активности, ингибирования продуктами, экономичность (скорости, температура, необходимость предобработки пластика).
- Оценка операций: период полураспада пластика в реакторе, расчёт потребной активности/массы биомассы.
8) Безопасность и риски
- Патогенность штаммов, резистентность к антибиотикам, переносимость плазмидных генов.
- Оценка образования токсичных промежуточных продуктов (эндокринные разрушители и т.д.).
- Мониторинг распространения генов in situ (qPCR на маркеры).
9) Метрики принятия решения (примерно)
- Репродуцируемая минерализация/потеря массы значительно выше контроля (стат. значимость).
- Установление идентифицируемого фермента(ов) с устойчивой активностью и приемлемыми кинетическими параметрами ($K_M,V_{max}$) и стабильностью в рабочих условиях.
- Экологическая безопасность (нет токсичности, нет передачи вредных генов).
Рекомендуемая последовательность (приоритеты)
1. Фенотипический скрининг: масса + CO${}_2$ + визуализация.
2. Химический анализ продуктов (GC-MS/FTIR) — подтверждение механизма.
3. Омics и белковая идентификация — найти кандидатов.
4. Биохимия рекомбинантных ферментов, кинетика и оптимизация.
5. Микрокосмы/мезокосмы, эко-тесты.
6. Масштабирование и оценка риска.
Если нужно, могу составить конкретные протоколы (объемы, времена инкубации, условия) для конкретного типа пластика (PET, PE, PS, PU и т.д.).