Кратко: причины делю на две группы — факторы среды (культуральные/физиологические) и генетические/молекулярные нарушения. Ниже — возможные причины, как их диагностировать и быстрые проверочные эксперименты.
1) Факторы среды — причины и диагностика
- Питание / метаболиты:
- Причина: исчерпание глюкозы, аминокислот, ростовых факторов; накопление лактата/токсичных метаболитов.
- Диагностика: измерить уровни глюкозы/лактата в среде; проверить частоту смены среды; метаболический анализ (Seahorse/LC‑MS).
- Быстрая проверка: заменить среду / добавить свежую сыворотку; временное восстановление пролиферации — подтверждение причины.
- pH и газовый режим:
- Причина: падение pH, некорректный CO2/окислительно-восстановительный режим, гипоксия.
- Диагностика: контроль pH фенол-редом; измерить CO2 (обычно $5\%$), кислород; $\mathrm{pH}$ среды (нормально $7.2-7.4$).
- Исправление: смена среды, проверка инкубатора.
- Температура / осмолярность:
- Причина: неправильная температура (обычно $37^{\circ }\mathrm{C}$) или осмотический стресс.
- Диагностика: проверка термостата, осмолярности.
- Контаминация:
- Причина: бактериальная/грибковая/микоплазменная инфекция, эндотоксины, вирусы.
- Диагностика: визуально (турбидность), микроскопия, микробиологический посев, Mycoplasma PCR/флюоресцентная DAPI/культура на индикаторных средах, эндотоксин‑LAL.
- Качество компонентов:
- Причина: некачественная сыворотка, деградировавшие ростовые факторы, адсорбция на пластике.
- Диагностика: сравнить с новой партией сыворотки/белка; контрольовые культуры.
- Подложка / плотность посева:
- Причина: неправильное покрытие ECM, слишком высокая/низкая плотность → контактная ингибиция или недостаток парритальных сигналов.
- Диагностика: изменить покрытие (коллаген/фибронектин), варьировать плотность посева.
- Оксидативный стресс / митохондриальная дисфункция:
- Диагностика: ROS‑ощущатели (DCFDA), митохондриальная мембранная потенция (JC‑1, TMRE), измерение ATP (CellTiter‑Glo).
- Исправление: антиоксиданты (N‑ацетилцистеин) — тест на восстановление.
2) Генетические / молекулярные изменения — причины и диагностика
- Активация проапоптотических путей / потеря анти‑апоптотических факторов:
- Частые гены: TP53 (активация апоптоза при повреждении ДНК), BAX/BAK↑; утрата BCL2, MCL1.
- Диагностика: RT‑qPCR/Western blot для p53, BCL2, MCL1, BAX; активность каспаз (Caspase‑3/7 assay); Annexin V/PI.
- Потеря сигналов пролиферации:
- Нарушения: снижение PI3K/AKT/mTOR, RAS/MAPK пути, рецепторные тирозинкиназы.
- Диагностика: фосфорилирование AKT/ERK (Western blot); экспрессия рецепторов; реактивация путей (ингибиторы/агонисты) как тест.
- ДНК‑повреждение / репликационный стресс:
- Диагностика: γ‑H2AX фокусы (иммунофлуоресценция/Western); Comet assay; клеточный цикл (PI/EdU).
- Хромосомные аномалии / копийное число:
- Диагностика: karyotype/CGH/array‑CGH, NGS (копийные изменения).
- Мутации, влияющие на апоптоз/популяционную стабильность:
- Диагностика: целевой NGS/панель онкогенных/опухолевых генов; Sanger для подтверждения.
- Эпигенетические изменения / регуляторная экспрессия miRNA:
- Диагностика: метиломные анализы, RNA‑seq, miRNA‑профилирование.
- Вирусная интеграция / латентная инфекция:
- Диагностика: PCR на вирусы, RNA‑seq для чужеродных транскриптов.
3) Какие конкретные эксперименты/ассайты провести сначала (пошагово, быстрый рабочий план)
1. Визуальная проверка и базовые параметры: морфология, pH, помутнение, смена среды, дата последней пассаже/плотность.
2. Контаминация: Mycoplasma PCR, микроскопия, посевы; если положительно — уничтожить/очистить линию.
3. Жизнеспособность и апоптоз: CellTiter‑Glo/MTT, Annexin V/PI, активность каспаз‑3/7. Порог: если апоптоз $>20\%$ — выраженный.
4. Клеточный цикл: PI‑анализ или EdU/BrdU для определения ареста в $G_1$/$S$/$G_2/M$.
5. ROS/митохондр.функция: DCFDA, JC‑1/TMRE, ATP.
6. ДНК‑повреждение: γ‑H2AX, Comet.
7. Белковая оценка ключевых путей: Western blot p53, p‑AKT, p‑ERK, BCL2 family, PARP‑кливоз.
8. Генетическая проверка (если проблемы сохраняются): STR аутентификация линии; targeted NGS панели (TP53, PI3KCA, PTEN, BCL2 family и т.д.) или WES/RNA‑seq при необходимости.
9. Rescue‑тесты: антиоксиданты, пан‑касказный ингибитор Z‑VAD‑FMK, добавление факторов роста/новая сыворотка, изменение плотности/подложки — если восстановление происходит, локализация причины скорее средовая/метаболическая.
4) Быстрые подсказки интерпретации
- Восстановление пролиферации после смены среды/сыворотки → проблема метаболической/питательной/сывороточной.
- Положительный Mycoplasma PCR/видимые контаминанты → устранение/пересев.
- Высокая активность каспаз + PARP кливаж → классический апоптоз; использовать Z‑VAD для проверки зависимости.
- Высокие ROS и потеря митохондр.потенциала → митохондриально‑опосредованный апоптоз.
- Активный p53 + γ‑H2AX → ответ на ДНК‑повреждение.
Если нужно, могу предложить конкретную панель тестов для вашей конкретной клеточной линии и протоколы (короткие протоколы для Annexin V, JC‑1, Mycoplasma PCR и т.д.).