Кратко о механизме и последствиях
- Аппарат Гольджи отвечает за модификации (в т.ч. N‑ и O‑гликозилирование, сульфирование, протеолитическую обработку), сортировку и упаковку белков/протеогликанов в везикулы. Его нарушение приводит к:
- задержке или накоплению белков в ЭР/пузырьках, снижению их секреции;
- неправильной/неполной гликозилизации и сульфированию → изменённой структуре и свойствам белков и GAG (протеогликанов);
- ошибочной сортировке (в т.ч. выбросу лизосомальных ферментов наружу);
- нарушению сборки внеклеточного матрикса (менее сульфированные GAG, дефектный коллаген/фибронектин) → снижение адгезии, механической прочности и изменения клеточной подвижности;
- активации ER‑стресса/UPR при накоплении незрелых белков.
Какие изменения ожидать в секреции и ECM (кратко)
- Уменьшение общего уровня секретируемых белков или их накопление внутри клетки.
- Сдвиг молекулярной массы белков (из‑за отсутствия сложных гликанов) — «облегчённые» формы на SDS‑PAGE.
- Снижение количества и/или сульфирования GAG; изменение состава гликопротеинов ECM (коллаген, протеогликаны, фибронектин).
- Повышение секретируемой активности лизосомальных ферментов (при ошибочной сортировке).
Методы для проверки этих эффектов (что измерять и ожидаемые результаты)
1. Биохимия секреции
- Пульс‑чейз с меченными аминокислотами (например, [35S]‑Met): измерить скорость выхода белка в среду и накопление в клетках. Ожидается замедленная или уменьшенная секреция.
- Western blot клеточных и внеклеточных фракций: сравнить уровни и подвижность (смещение полос вследствие потери гликанов).
- ELISA/иммуноблотинг секретируемых ECM‑белков (коллаген, фибронектин, малыe протеогликаны).
2. Анализ гликозилирования/модификаций
- Обработка Endo H и PNGase F: Endo H‑чувствительность указывает на незрелую маннозную форму; PNGase F убирает все N‑гликаны — даст изменение массы. Ожидается повышенная чувствительность к Endo H при нарушенном транспорте через Гольджи.
- Lectin blot/флуоресцентная детекция (WGA, ConA, PNA и др.) для определения изменений гликанов.
- Масспектрометрия гликиномики — точный профиль структур гликанов.
3. Клеточная локализация и морфология
- Иммунофлуоресценция: маркеры Гольджи (GM130, TGN46), ER (calnexin), и исследуемые белки — увидеть их задержку/ретенцию.
- Конфокальная/электронная микроскопия: оценить дезорганизацию Golgi‑стэков и накопление везикул.
4. Функциональные и количественные тесты ECM
- Оценка GAG: DMMB (диметилметилен‑синий) для сульфатированных GAG; Alcian Blue окраска матрица на культурах. Ожидается снижение сигналов или изменение подтипов GAG.
- Коллаген‑типичные анализы: SDS‑PAGE/пептидный профиль проколлагенов; клеточные ассеи на сборку фибрилл (иммуноморфология).
- Зимография и активность MMPs/протеаз в среде.
5. Трафик секреторного белка в реальном времени
- VSVG‑ts045‑GFP (температурно‑чувствительный): термошоковый релеаз и наблюдение транспорта через ER→Golgi→плазм. membrane. При дефекте задержка на Golgi/ER.
- FRAP/живое‑клеточное изображение для кинетики везикулярного трафика.
6. Проверка лизосомной сортировки и секреции ферментов
- Активность лизосомальных ферментов в среде и в лизате (наследование M6P‑маркировки нарушит доставку в лизосомы) — повышение активности в среде указывает на миссортировку.
7. Молекулярные вмешательства и контрольные эксперименты
- Индуцировать или имитировать дефект: Brefeldin A, monensin (химические ингибиторы) или генетические потери (RNAi/CRISPR для ARF1, COPI, golgins). Сравнить фенотипы с экспериментальной моделью.
- Контроли: восстановление экспрессии (rescue), нагрузка ER (Tunamycin для блока N‑гликозилирования) для разделения эффектов.
Дополнительные маркеры ответа клетки
- Оценка UPR/ER‑стресса (BiP/GRP78, CHOP, XBP1 splicing) — при выраженном нарушении Гольджи часто вторично активируется ER‑стресс.
Краткие рекомендации по плану эксперимента
- Начать с Western blot/ELISA секретируемых белков + пульс‑чейз; параллельно делать обработку Endo H/PNGase F и лектины.
- Параллельно иммунофлуоресценция Golgi/ER и VSVG‑трафик для кинетики.
- Для ECM — DMMB/Alcian Blue и масс‑спектрометрия/LC‑MS гликанов при необходимости детализации.
Если нужно, могу предложить конкретную панель маркеров и пошаговый протокол для вашей системы (клеточный тип, белок/протеогликан интереса).