Кратко — какие эксперименты и анализы провести и как интерпретировать результаты.
1) Первичные контролы (перед глубоким анализом)
- Использовать минимум $3$ независимые линии/фондера, созданные разными gRNA или изолированными от разных эмбрионов. Повторяемость фенотипа в всех линиях уменьшает вероятность случайного офф‑таргета.
- Литтер‑контролы и одинаково обработанные контролируемые животные (шам Cas9 без gRNA, gRNA без Cas9).
- Проверить мозаичность методом генотипирования тканей (кожа, печень, мозг): если мозаичность — интерпретация меняется.
2) Тесты на офф‑таргетные эффекты
- В‑силу предсказаний: in silico прогноз офф‑таргетов (например, с учётом PAM), затем глубокая ампликон‑ПЦР/NGS для топ‑$20$–$50$ предсказанных сайтов.
- Глобальные методы обнаружения офф‑таргетов: GUIDE‑seq, CIRCLE‑seq, Digenome‑seq или SITE‑seq (в клетках/in vitro) — затем проверка найденных сайтов в ДНК животных ампликон‑NGS.
- WGS (целый геном) у основного фаундера/пары фаундер‑контроль для выявления непредвиденных вставок/делеций/реарранжировок — особенно если фенотип сильный.
- Сравнить с использованием высокоточной версии Cas9 (HiFi, eSpCas9) или альтернативного нуклеазы (Cas12a) — если фенотип исчезает при использовании высоко‑чистой нуклеазы, подозрение на офф‑таргет усиливается.
- Реверсия мутации (контрактирование): восстановление исходного аллеля (через HDR или базовый редактор) в линии, где фенотип есть — обратная корреляция подтверждает он‑таргет. Альтернатива — экспрессия WT‑домена (транслокированный транcген) для рескейпа.
3) Тесты на компенсацию/транскрипционную адаптацию
- RNA‑seq (bulk) и qPCR — искать upregulation паралогов, функционально связанных генов. Сильная специфическая индукция паралогов — признак компенсации.
- Сравнить остроту фенотипа при острой (взрослой) индукции и при конститутивном делеции: использовать условную систему (Cre‑loxP) или индуцируемый Cas9 (AAV‑Cas9 в взрослом животном). Компенсация развивается во время развития; если острая делеция вызывает более тяжёлый фенотип — власть за компенсацией.
- Проверить наличие нуклеотидных изменений, вызывающих NMD: если мутантный транскрипт деградирует → транскрипционная адаптация (mutant mRNA decay → upregulation related genes). Проверить уровни мутантного мРНК и эффект ингибирования NMD.
- Proteomics / Western blot / Ribo‑seq — компенсация может быть посттранскрипционной; ищите изменение уровней белков-паралогов или активацию путей.
4) Оценка влияния генетического фона
- Backcross на чистый inbred фон $N$ поколений (обычно рекомендуют $6-10$ поколений) или создать конгенную линию; тестировать фенотип на разных чистых штаммах (C57BL/6, BALB/c и т.п.). Если фенотип меняется/исчезает — подтекущий фон.
- Проанализировать вариабельность между помётами/штампами; использовать littermate‑контроли.
- SNP‑генотипирование / WGS для выявления пассенджерных участков, оставшихся от донора или случайных перестроек; провести QTL‑mapping, если фенотип полифенотипичен.
- Создать F1 гибриды (смесь двух штаммов) и проверить фенотип — доминантные фоновые эффекты проявятся.
5) Практическая последовательность действий (рекомендуемая)
- A. Подтвердить генотип и отсутствие крупномасштабных перестроек (PCR, Sanger, WGS по возможности).
- B. Создать/тестировать $\ge 3$ независимых линий (разные gRNA/фондера).
- C. Попробовать рескейп (WT‑транcген или реверсия мутации).
- D. Выполнить RNA‑seq + proteomics для выявления компенсации; сравнить конститутивную и акуальную (индуцируемую) делецию.
- E. Провести офф‑таргетные анализы (GUIDE/CIRCLE/Digenome + targeted deep‑seq).
- F. Backcross на чистый фон и/или протестировать на нескольких фондах; если возможно — QTL/SNP‑анализ.
6) Интерпретация результатов — ориентиры
- Фенотип устойчив в нескольких независимых аллелях, реверсируется рескейпом и воспроизводим при использовании высоко‑чистой нуклеазы → скорее он‑таргетный эффект.
- Фенотип варьирует с генетическим фоном или исчезает после бэккросса → влияние фоновых модификаторов.
- Острая делеция даёт сильный фенотип, а конститутивный — слабый/отсутствует + RNA‑seq показывает upregulation паралогов/путей → вероятность компенсации.
- Наличие неожиданных мутаций в других участках генома / подтверждённые офф‑таргетные индели в функц. генах → офф‑таргетный вклад.
7) Дополнительные рекомендации
- Всегда использовать littermate и одинаково обработанные контролы.
- Документировать процедуру редактирования, версии Cas9, последовательности gRNA и проверенные офф‑таргет‑сайты.
- Комбинировать геномные (WGS), таргетные (amplicon NGS) и транскрипционные/протеомные подходы для комплексной интерпретации.
Если хотите, могу предложить конкретную схему экспериментов и панель сайтов для ампликон‑секвенирования, если вы пришлёте gRNA‑последовательность и первичные данные по фенотипу.