Кратко и по сути — как мутации влияют и как это проверить.
1) Как мутации в промоторе меняют экспрессию
- Механизмы:
- Нарушение сайтов связывания транскрипционных факторов (TF) уменьшает/увеличивает активность промотора.
- Мутации в сердцевине промотора (TATA, INR, BRE и т.п.) меняют инициацию транскрипции.
- Изменение CpG‑островков или создание/удаление сайтов для факторов, влияющих на хроматин, меняет доступность ДНК.
- Нарушение элементов связи с энхансерами/сайленсерами меняет уровень транскрипции и/или её клеточно‑специфичность.
- Ожидаемый эффект на уровни РНК/белка (упрощённо):
- при стационарном состоянии концентрация мРНК $m$ определяется скоростью синтеза $k_{syn}$ и скоростью деградации $k_{deg}$:
$$m=\frac{k_{syn}}{k_{deg}}.$$ - занятость сайта TF можно аппроксимировать как насыщение:
$$\mathrm{occupancy}\propto \frac{[TF]}{[TF]+K_d},$$ где уменьшение аффинности (увеличение $K_d$) снижает транскрипционную активацию.
2) Как мутации в зонах сплайсинга меняют экспрессию
- Механизмы:
- Мутации в консервативных положении 5'‑/3'‑сплайс‑сайтов или в ветке‑point приводят к пропуску экзона, удерживанию интрона или использованию криптических сайтов.
- Изменения в экзонных/интронных сплайсинг‑энхансерах/силенсерах меняют узнавание экзонов регулировочными RBP.
- Сдвиги рамки приводят к преждевременным стоп‑кодонам и активации NMD (неграмотная деградация мРНК), что уменьшает уровень транскрипта и белка.
- Для количественной оценки альтернативного сплайсинга часто используют PSI (percent spliced‑in):
$$\Psi =\frac{{\text{reads}}_{\text{inclusion}}}{{\text{reads}}_{\text{inclusion}}+{\text{reads}}_{\text{exclusion}}}.$$
3) Какие методы использовать для экспериментального подтверждения (концептуально, без пошаговых инструкций)
- Для промотора:
- Репортерные гены (люцифераза/GFP): сравнение активности промотора WT vs мутант; даёт прямую оценку изменения транскрипционной активности (ожидаемая величина — fold‑change $\frac{\text{mutант}}{\text{WT}}$).
- Хроматин‑ориентированные методы: ChIP/ChIP‑seq против конкретных TF или активных маркеров (H3K4me3, H3K27ac) — проверяет изменение связывания/хроматинового состояния; ATAC‑seq/DNase‑seq — доступность хроматина.
- Белковая аффинность in vitro / биофизика (EMSA, SPR, MST) — показывает изменение связывания TF к мутантной последовательности (концептуально: изменение $K_d$).
- Оценка транскрипции/транскриптома: qRT‑PCR/ RNA‑seq / nascent RNA методы (GRO/PRO‑seq) — отличают изменение скорости транскрипции от изменений стабильности РНК.
- Аллель‑специфическое экспрессирование (в гетерозиготах) — показывает cis‑эффекты промотора.
- Для сплайсинга:
- RNA‑seq с анализом сплайс‑джанкций — обнаруживает изменения PSI, появление новых транскриптов, удержание интронов, чтения по рамке.
- Минеген‑сплайсинг‑ассай (minigene) — вставка соответствующего локуса с/без мутации в репортёрную конструкцию и сравнение паттернов сплайсинга (концептуально подтверждает влияние локальной последовательности).
- RT‑PCR/амплификация с мостовыми праймерами для экзон‑экзонных джанкций — быстрый контроль изменения включения экзона (результат интерпретируется как изменение PSI).
- CLIP/CLIP‑seq или RIP — проверяют, изменилось ли связывание сплайс‑регуляторных белков (RBP) с мутантной РНК.
- Тесты на NMD: сравнение уровня транскрипта/белка при ингибировании деградации (концептуально выявляет, вызвана ли потеря RNA NMD).
4) Как интерпретировать результаты (что считать доказательством)
- Промотор: снижение/повышение активности в репортере, совпадающее с изменением эндогенной мРНК (qRT‑PCR/RNA‑seq) и с уменьшением связывания TF (ChIP/EMSA), указывает на прямой cis‑эффект промоторной мутации.
- Сплайсинг: сдвиг в PSI или появление альтернативных джанкций в RNA‑seq и воспроизведение фенотипа в минегене — сильное доказательство влияния мутации на сплайсинг; дополнительное восстановление нормального сплайсинга при модификации RBP или при подавлении NMD уточняет механизм.
- Желательно комбинировать уровни данных: ДНК (вариант), РНК (количество и сплайсинг), белок (уровень/функция) и связывающие белки/хроматин.
Если нужно, могу кратко предложить оптимальный набор экспериментов для конкретного случая (тип мутации, модельная система, какие контролы полезны) — укажите контекст.