Кратко — сначала проверяйте те технологические факторы, которые напрямую влияют на среду культивирования и экспрессию, затем ключевые биологические параметры продукта и клетки. Ниже — список приоритетных пунктов с кратким пояснением и что измерить/проверить.
Технологические факторы (проверить в первую очередь)
- Кислородный режим и массовый перенос кислорода: измерить DO, оценить $k_{L}a$ и OTR. Формула для OTR: $\mathrm{OTR}=k_{L}a(C^{\ast }-C_{DO})$. Снижение $k_{L}a$ при масштабировании — частая причина падения активности.
- Аэрация / перемешивание / гидродинамика: проверить скорость мешалки, число оборотов, конфигурацию импеллера, расход газа; оценить специфическую мощность $P/V$ и скорость на конце лопасти $u_t$ ($u_t\approx \pi DN$). Нехватка перемешивания даёт градиенты по субстрату, О2, pH.
- Градиенты времени смешивания: измерить $t_{mix}$. На больших танках растут локальные перепады pH/температуры/субстрата — это влияет на фолдинг и модификации.
- Температура и её контроль: локальные перегревы/охлаждение, калибровка датчиков.
- pH и буферная ёмкость: проверить профиль pH, буферизацию, корректность подачи титранта.
- Подкормка / стратегия питания (fed‑batch): проверьте скорости подачи субстрата, остаточный глюкозы/субстрата, наличие overflow‑метаболитов (например ацетат у E. coli).
- Пена и антифоамер: концентрация антифоама может снижать $k_{L}a$ и/или ингибировать продукт.
- Механическая инактивация: повышенный сдвиг/срез (shear) может разрушать чувствительные белки.
- Системы дозирования и индукции: точность подачи индуктора (IPTG, арабиноза, тетрациклин и т.п.), временные задержки при масштабировании.
Биологические факторы (проверить параллельно)
- Жизнеспособность и физиологическое состояние клеток: измерить Viability, OD/biomass $X$, метаболические маркеры; плохое состояние уменьшает специфическую активность.
- Плазмидная стабильность и копия: доля клеток, сохраняющих плазмиду; проверить селективную среду/антимикробный уровень.
- Уровень экспрессии и транскрипция/трансляция: qPCR/Western для мРНК и белка; погрешности индукции на масштабе.
- Фолдинг и агрегация: доля растворного vs агрегированного (inclusion bodies); SDS‑PAGE/супернатант/пенетрат.
- Пост‑трансляционные модификации (если релевантно): гликозиляция, дисульфидные связи — сравнить профиль модификаций (MS, IEF).
- Протеолиз: повышение активности протеаз при масштабировании — измерить уровни протеаз, добавить ингибиторы/изменить температуру.
- Липиды/средовые компоненты, влияющие на активность: наличие летучих метаболитов, изменения солёности/ионной силы.
- Нозологические изменения (мутации, адаптация): повторная секвенция конструкта/штамма при длительной культивировке.
- Влияние матрицы (если секретируется): изменение условий секреции, накопление в периплазме/среде.
Что конкретно измерить/сделать в первую очередь (приоритет)
1. Проверить и откалибровать DO, pH, температуру; замерить профиль во времени в различных зонах бака.
2. Оценить $k_{L}a$ и $P/V$ на новой установке, сравнить с лабораторными значениями.
3. Измерить остаточный субстрат и основные побочные метаболиты (ацетат, этанол) и жизнеспособность клеток.
4. Сравнить уровень целевого белка (SDS‑PAGE, Western) и специфическую активность между рулонами (lab vs plant).
5. Проверить плазмидную стабильность и корректность индукции (концентрация/время).
6. Оценить наличие протеолиза и агрегатов; при необходимости провести масс‑спектрометрию для изменения PTM.
Краткие возможные коррективы
- Увеличить аэрацию/перемешивание или изменить конфигурацию импеллера; повысить $k_{L}a$.
- Скорректировать стратегию кормления, снизить перегрузку субстрата, избежать overflow.
- Оптимизировать время/концентрацию индуктора и температуру индукции (часто понижение температуры улучшает фолдинг).
- Добавить ингибиторы протеаз/снижать время пребывания продукта в клетке/среде.
- Пересмотреть использование антифоама и места ввода растворителей/реагентов.
Если нужно, могу предложить чек‑лист с приоритетом действий и набором тестов для вашей конкретной установки/организма — укажите систему (E. coli, CHO, Pichia и т.п.) и масштаб.