Краткий план исследования и этические моменты.
1) Генетическая приоритизация и валидация кандидатов
- Подтвердить все кандидаты методом Сэнгера (валидация нуклеотидных изменений).
- Исключить артефакты секвенирования (проверить качество чтений, глубину покрытия $>30\times$).
- Оценить частоту аллелей в популяционных базах (gnomAD и др.); для предполагаемой редкой рецессивной болезни учитывать порог частоты, например $<0.01$ или строже $<0.001$.
- Вспомогательные in silico‑методы: предсказатели болезненности для замещений, анализ сплайсинга, консервация, структурные модели. Эти данные — вспомогательные, не окончательные.
2) Семейный анализ (сегрегация, фаза, статистика)
- Просегрегировать варианты у всех доступных членов семьи (аффекты/носители/не затронутые). Фазирование для подтверждения компаунд-гетерозиготности или гомозиготности.
- Если семья большая/есть несколько поражённых — сделать вычисление LOD‑score для проверки связи; порог статистической значимости LOD $>3$ (классическая граница).
- Если подозрение на консангвинальность — выполнить генотипирование/глубокое ро́дословное картирование (homozygosity mapping) для поиска участка гомозиготности.
- Подумать о дополнительном секвенировании (WGS) на наличие структурных вариантов, CNV, глубоко интронных изменений.
3) Функциональные in vitro‑тесты
- Проверить экспрессию РНК в доступных тканях/клетках пациента: RT‑PCR/квантитативный PCR, поиск сдвигов сплайсинга, NMD.
- Minigene‑эксперименты для подтверждения сплайс‑эффекта.
- Белковый уровень: вестерн‑блот, устойчивость белка, посттрансляционные модификации.
- Функция белка: ферментативные тесты (если применимо), связывание лигандов, ионный транспорт, сигнальные пути — измерять биохимическую активность в сравнении WT vs вариант.
- Клеточные фенотипы: локализация (иммунофлуоресценция), клеточная пролиферация/апоптоз, митохондриальная функция и т.п.
- Перформ‑ и реституция (rescue): экспрессировать WT ген в клетках пациента или в клеточной линии с KO/вариантом; восстановление функции подтверждает причинную роль.
- Использовать изогенные линии, полученные CRISPR/Cas9 (knock‑in и knock‑out), чтобы исключить фоновые эффекты.
4) in vivo‑модели
- Быстрые модели для скрининга: zebrafish или Drosophila (эффекты морфологии/функции) с потерей функции и последующей резcue с человеческим WT/вариантным трансгеном.
- Мышиная модель (knock‑in) для репродукции фенотипа, особенно если требуется изучить физиологию/развитие.
- Оценить соответствие фенотипов у модели и человека, провести молекулярные и поведенческие тесты.
- Всегда включать контроль восстановления функции WT транскриптом или протеином.
5) Интерпретация, критерии доказательной связи
- Применить рекомендации ACMG/AMP: PS3 (функциональные данные), PP1 (сегрегация), PM2 (редкость в популяции) и т.д. Учитывать суммарную силу доказательств.
- Документировать все отрицательные данные (отсутствие эффекта в определённом тесте тоже важно).
- Если несколько кандидатов — сравнить силу генетических и функциональных доказательств для каждого; при необходимости выполнить параллельные knock‑out/knock‑in эксперименты для определения причинного гена.
6) Контроль качества и статистика
- Использовать реплики и независимые эксперименты; включать позитивные и негативные контроли.
- Для количественных тестов указывать число повторов и статистические тесты; коррекция на множественные сравнения при множественных кандидатах.
7) Этические вопросы при публикации и распространении данных
- Информированное согласие: получение согласия на генетическое исследование, на публикацию результатов и на депонирование последовательностей/вариантов в общедоступных базах (ClinVar, GEO/ArrayExpress). Уточнить объём раскрываемой информации.
- Возврат результатов семье: иметь план возврата клинически значимых находок, предлагать генетическое консультирование; обсуждать, какие результаты сообщать (патогенные/вероятно патогенные/ВОИ — варианты неопределённого значения).
- Конфиденциальность и де‑идентификация данных; избегать публикации легко узнаваемых клинических изображений без отдельного согласия.
- Инцидентные находки и предиктивная информация (наследственные риски, репродуктивные решения) — дать доступ к консультации.
- Согласие на биобанкирование и будущие исследования; право на отзыв согласия.
- Публикация и авторство: честное указание вклада клиницистов, лабораторий и семьи; при участии коммерческих партнёров указывать конфликты интересов.
- Животные модели: этическое одобрение экспериментов (IACUC/эквивалент), минимизация страданий.
- Пересмотр интерпретации: уведомление семьи о том, что классификация варианта может измениться со временем и возможен повторный контакт.
- Социально‑правовые последствия: риски дискриминации, страховой информации — информировать о локальном регулировании и правах пациента.
Коротко о приоритете действий: сначала подтвердить и просегрегировать варианты в семье, затем нацеленно провести функциональные тесты, способные доказать механистическую связь (rescue, knock‑in/knock‑out). Параллельно обеспечить информированное согласие и план возврата результатов для семьи, а при публикации — депонировать данные в открытых базах с сохранением конфиденциальности.