Кратко и по делу — как читать и корректно анализировать AFM force–distance (F–d) кривые для живых клеток, какие артефакты мешают и какие калибровки/методики нужны.
1) Что именно читают в F–d кривой
- Разделы: приближение (approach) — контакт — индетнация (indentation) — отвод (retract). Контактная точка $z_{\text{cp}}$ — ключевая: отсчёт индентации от неё.
- Перевод сырых данных (напряжение фотодиода $V$, перемещение пьезо $z$) в силу и индентацию:
$$d=SV,F=k_{c}d$$ $$\delta =z-z_{\text{cp}}-d$$ где $S$ — inverse optical lever sensitivity (nm/V), $k_c$ — жёсткость кантилевера (N/m), $d$ — прогиб (nm), $\delta$ — индентация (nm).
- Для получения модуля упругости выбирают контактную модель (Hertz, Sneddon, JKR/DMT при адгезии) и подгоняют модель к зависимости $F(\delta )$ на диапазоне индентаций.
2) Типичные контактные модели (основные формулы)
- Сферический индентер (Hertz, без адгезии):
$$F=\frac{4}{3}{E}^{\ast }{R}^{1/2}{\delta }^{3/2},E^{\ast }=\frac{E}{1-{\nu }^2}$$ - Конический (Sneddon):
$$F=\frac{2}{\pi }{E}^{\ast }\tan \alpha {\delta }^2$$ - При заметной адгезии выбирают JKR или DMT; выбор зависит от Tabor-параметра $\mu$ (высокая $\mu$ → JKR, малая → DMT):
$$\mu ={\left(\frac{R\Delta {\gamma }^2}{E^{\ast 2}{z}_0^3}\right)}^{1/3}$$ (в практической работе чаще руководствуются экспериментальной кривой: наличие сильной гистерезисной адгезии → JKR).
3) Основные артефакты и как их обнаружить/исправить
- Адгезия между наконечником и мембраной
- Симптом: заметная отрицательная сила при отводе, гистерезис.
- Исправление: учесть адгезию моделью (JKR/DMT), либо уменьшать адгезию (покрытие щадящим слоем, буфер), использовать более крупный радиус (коллоидный зонд) для ослабления локальных сил.
- Гидродинамика / вязкость среды
- Симптом: наклон базовой линии в области вне контакта и/или скорость‑зависимые силы, разница approach/retract вне контакта.
- Исправление: измерить зависимость от скорости, вычесть гидродинамическую составляющую (линейную по скорости) либо работать на достаточно медленных скоростях; при необходимости моделировать вязкое сопротивление (drag на кантилевер, squeeze‑film между зондом и поверхностью).
- Деформация подложки (тонкий слой клетки на твёрдом субстрате)
- Симптом: кажущаяся «жёсткость» при больших индетнациях; зависимость оценённого E от глубины индентации/толщины клетки.
- Исправление: ограничивать глубину индентации ($<10\text{–}20\%$ высоты клетки) или применять поправки для конечной толщины (Dimitriadis и др.): по сути
$$F=F_{\text{Hertz}}\cdot \kappa (\delta /h)$$ где $\kappa (\delta /h)$ — корректирующий множитель, зависящий от соотношения индентации к толщине $h$.
- Геометрия зонда и её неопределённость
- Малые радиусы острого зонда дают чувствительную зависимость силы от случайной структуры мембраны; коллоидные зонды (R ~ 1–5 μm) даёт лучшую статистику и проще модель.
- Неправильная калибровка (k_c и S)
- Неправильный $k_c$ даёт пропорциональную ошибку в F; неправильный $S$ даёт ошибку в $\delta$ и F.
- Проверять калибровки регулярно и в тех же условиях (температура, среда).
4) Рекомендации по калибровке и процедурам измерения
- Измерение $S$ (invOLS): на твёрдом субстрате в том же флюиде, брать наклон контактной части approach. Повторять для каждой комбинации пробник/среда.
- Калибровка жёсткости $k_c$:
- Тепловой метод (thermal noise):
$$k_c=\frac{k_{B}T}{S^2⟨V^2⟩}$$ где $⟨V^2⟩$ — дисперсия сигнала в вольтах, $k_B$ — постоянная Больцмана, $T$ — температура.
- Альтернатива: Sader‑метод (для кантилеверов в флюиде) — учитывать геометрию и гидродинамический фактор.
- Используйте коллоидные зонды для более надёжного применения контактных моделей и меньшей локальной механической неоднородности.
- Выбирайте глубину индентации: обычно $<10\%$ высоты клетки, если нужно исследовать только кортикальную жесткость; глубже — ожидайте вклад ядра и субстрата.
- Скорости: измеряйте при нескольких скоростях для выявления вязкоупругости; при необходимости моделируйте с Kelvin‑Voigt или стандартной линейной моделью.
- Контроль качества данных: исключать точки с плохой подгонкой, артефактные «шумы», скачки контактной точки; использовать автоматизированную детекцию контактной точки с визуальной проверкой.
5) Анализ данных и оценка неопределённостей
- Подгоняйте модель только на корректном диапазоне индентации (обычно исключают первые несколько нм из‑за поверхностной шероховатости/адсорбата и очень большие индентации из‑за субстрата).
- Оценивайте чувствительность коэффициента упругости к выбору диапазона подгонки и контактной точки (parametric sensitivity). Делайте бутстрэппинг или доверительные интервалы.
- Проверяйте скорость‑зависимость: если модуль меняется с частотой/скоростью — нужен вязкоупругий анализ (частотный AFM, force‑relaxation или creep тесты).
- Протокол статистики: измерять множество точек на разных клетках и участках, приводить медиану/среднее и разброс (IQR, std).
6) Практический чек‑лист перед публикацией/выводами
- Калибровка: $S$ на твёрдом субстрате в среде, $k_c$ (thermal/Sader), проверка геометрии зонда.
- Использование адекватного зонда (коллоидный для биосэмплов), ограничение глубины индентации, несколько скоростей измерения.
- Вычитание/коррекция гидродинамики и базовой линии, явная обработка адгезии (или её исключение).
- Применение корректирующих факторов для толщины слоя при необходимости (Dimitriadis и др.).
- Оценка погрешностей и чувствительности, статистическая выборка.
Коротко: правильная интерпретация требует корректного перевода сигнала в силу и индентацию, выбора подходящей контактной модели (и учёта адгезии), контроля гидродинамики и эффекта подложки, аккуратной калибровки $S$ и $k_c$, использования коллоидных зондов и анализа скорости для разделения упругой и вязкой составляющих.