Abbe: физическое ограничение и формулы
- Разрешающая способность обусловлена дифракцией света — микроскоп пропускает только пространственные частоты до среза. Классическая формула Аббе для поперечного (латерального) разрешения:
$$d=\frac{\lambda }{2\mathrm{NA}},$$ где $\mathrm{NA}=n\sin \alpha$ — числовая апертура ( $n$ — показатель преломления среды, $\alpha$ — полуугол апертуры). Часто используется критерий Рэлей: $d=0.61\lambda /\mathrm{NA}.$ - Частотный срез (cut‑off) оптики:
$$f_c=\frac{2\mathrm{NA}}{\lambda },$$ то есть нельзя передать пространственные частоты выше $f_c$.
- Осьовое (задне‑переднее) разрешение порядка
$$d_z\sim \frac{2n\lambda }{{\mathrm{NA}}^2}.$$
Фундаментальные ограничения (помимо геометрической оптики)
- Дифракция (описано выше) — фундаментальный фильтр пространственных частот.
- Фотонная статистика (шот‑шум): точность измерения ограничена числом зарегистрированных фотонов (CRLB).
- Фотофизика меток: фотоблекание, спайкинг/блёкинг, скорость переключения.
- Насыщенность сигналов, фон и аберрации оптики — ухудшают эффективное разрешение.
- Плотность маркировки / условие Найквиста: для реконструкции структур нужны метки с шагом меньше желаемого разрешения.
Как современные приёмы обходят ограничения
1) STED (Stimulated Emission Depletion)
- Идея: сначала возбуждают флуорофор, затем локально «выжигают» возбужденные молекулы стимулированным вынужденным излучением с помощью светового пучка в форме доната, оставляя эмиссию только в мелкой центральной зоне. Это нелинейно сжимает эффективный PSF.
- Разрешение примерно масштабируется как
$$d\approx \frac{\lambda }{2\mathrm{NA}\sqrt{1+I/I_{sat}}},$$ где $I$ — интенсивность депопулирующего пучка, $I_{sat}$ — интенсивность насыщения флуорофора.
- Ограничения: высокие интенсивности (фототоксичность, фотоблекание), требуются подходящие красители и точная оптика; сканируемая техника (скорость ограничения).
2) PALM / STORM (стохастическая локализация единичных молекул)
- Идея: в каждый кадр случайно активируются и измеряются редкие отдельные флуорофоры; положение каждой локализуют с высокой точностью путем подгонки PSF. Затем собирают карту из многих локализаций.
- Локализационная точность (в простом приближении) задаётся
$$\sigma \approx \frac{s}{\sqrt{N}},$$ где $s$ — ширина PSF, $N$ — число собранных фотонов от одного флюорофора (более точные выражения учитывают пиксельный шаг и фон).
- Достоинство: достигают десятки нанометров и меньше. Ограничения: требуется много кадров (медленная реконструкция), зависимость от фотофизики меток и плотности маркировки (нужен подходящий Nyquist), плохая применимость к быстрым живым процессам при высокой пространственно‑временной нагрузке.
3) Структурированная подсветка (SIM)
- Идея: освещают образ регулярной решёткой/паттерном; высокие пространственные частоты объекта перемещаются (складываются) в пропускаемую область (модуляция → Муар), затем по набору фаз/ориентаций восстанавливают спектр объекта. Линейный SIM даёт до 2× повышение по разрешению:
$$d_{SIM}\approx \frac{d_{Abbe}}{2}=\frac{\lambda }{4\mathrm{NA}}.$$ - Нелинейный (saturated) SIM использует насыщение флуоресценции для получения высших гармоник и большего превосходства по разрешению.
- Ограничения: требует аккуратной калибровки и реконструкции (артефакты), в линейном варианте ограничено ~2×; нелинейные режимы требуют сильных озарений или специальных красителей.
Коротко о практических трейд‑оффах
- Все сверхразрешающие методы достигли обхода «Аббе» за счёт использования нелинейности, стохастики либо вычислительной обработки и/или введения дополнительных измерений. Но они платят: повышенная сложность, фотоповреждение/блекание, требования к меткам, более длительная съёмка или вычисления, чувствительность к фону и аберрациям.
- Доп. подходы (коротко): 4Pi/коконфокальная оптика для осевого улучшения, MINFLUX комбинирует идеи локализации и STED для субнанометровой локализации, экспанзионная микроскопия физически увеличивает образ.