Ниже — практическая пошаговая стратегия для идентификации неизвестных органических пиков, выявленных при ИК‑аналитике питьевой воды. Включаю пробоподготовку, сочетание аналитических методов (GC, LC, MS, NMR), а также подходы к работе со смешанными спектрами и критерием уверенности в идентификации.

Краткая логика: 1) собрать и сконцентрировать матрицу, 2) грубо классифицировать по летучести/полярности, 3) разделить/фракционировать, 4) измерить GC‑MS (для летучих/полузлетучих) и LC‑HRMS (для полярных/нелетучих), 5) сделать MS/MS и in‑silico поиск, 6) изолировать/концентрировать для подтверждения NMR (или синтез/покупка стандарта), 7) применить деконволюцию/химометрические подходы для смешанных сигналов.

Отбор проб и сохранение

Объём: для низких концентраций (нг/л—мкг/л) берите 1–10 л, в зависимости от ожиданий по содержанию.Посуда: стеклянная или инертная (PTFE), минимизировать пластмассовую адсорбцию.Консервация/хранение: охлаждение (4 °C), темно; избегать сильных окислителей. При необходимости добавлять биоцид (NaN3) или замораживать.Контроль: полевой бланк, лабораторный бланк, спайк‑контроль для оценки потерь.

Пробоподготовка и предварительное разделение

Цель: концентрация ана­лизируемых веществ и предварительное разделение по полярности/заряду.SPE (основной «рабочий конь»): Типы: HLB (универсальный), C18 (аполяр), WAX/SAX (ионный обмен для кислот/оснований). Подготовка: pH‑регулировка для экстракции кислот (кислый pH), оснований (щелочной pH).Элюция: метанол/ацетонитрил, для аполярных — дихлорметан/гексан.Фракционирование: делайте последовательную элюцию разными растворителями или используйте несколько видов картриджей, чтобы получить фракции разной полярности.Liquid–liquid extraction (LLE): для органических растворителей/неполярных, полезно перед GC.SPME/Headspace: для летучих/ароматических соединений.Диализ/фильтрация, если матрица содержит коллоиды.Концентрация экстрактов: ротационный испаритель, N2‑струя; перевод в подходящий растворитель для последующего анализа (hexane/DCM для GC, MeOH/ACN для LC, DMSO/D2O для NMR).

Первичная классификация по физико‑химическим свойствам

IR‑полосы дают подсказку о функциональных группах (карбонилы, карбоксильные, гидроксильные, аминогруппы, ароматичность). Используйте это как ориентир: предполагаемые кислоты, эфиры, спирты, нитросоединения и т.д.Решение по дальнейшей трассе:Летучие/полузлетучие, термостойкие → GC‑MS (+ дериватизация для полярных).Полярные/нелетучие → LC‑HRMS (ESI ±, APCI).Очень малые уровни → предварительное накопление и/или концентрирование фракций.

GC‑MS (для летучих и деривативных форм)

Подготовка: дериватизация полярных групп (BSTFA или MSTFA для силикозации – OH, COOH, NH; метилирование карбоновых кислот хлориду метила или диазометаном).Режим: EI 70 eV для библиотечного поиска (NIST), CI для молекулярного ионного подтверждения.Деконволюция: AMDIS или аналогичные для выделения перекрывающихся масс‑спектров.Ковaтс‑индексы (RI): измерьте и сравните с библиотеками.Если смесь сложная → GC×GC‑MS для большей разделяющей способности.

LC‑HRMS (для полярных и термолабильных)

Аппаратура: QTOF или Orbitrap с высокой точностью (<5 ppm желательны).Ионные режимы: ESI+ и ESI− обязательно (некоторые соединения ионизируются только в одном режиме); APCI для менее полярных.MS/MS: DDA (data dependent) + DIA (all‑ions) для сбора фрагментов.Аддукты и ионные формы: учитывать [M+H]+, [M+Na]+, [M−H]−, кластеры; использовать софт для распознавания аддуктов (MZmine, MS‑Dial).Хроматографические режимы: RP (C18) для умеренно полярных, HILIC для очень полярных, ion‑pairing по необходимости.Используйте внутренние стандарты (изотопные) для контроля потерь/матрицы.

Обработка MS‑данных и идентификация кандидатов

Первичная обработка: выравнивание пиков, фильтрация по сигнал/шум, убрать фоны/бланки.Деконволюция перекрывающихся пиков: MS‑Dial, MZmine, XCMS, AMDIS (для GC).Точная масса → формула (C/H/O/N/S/Cl/Br) с учётом изотопных паттернов (Cl, Br дают характерные изотопные соотношения).MS/MS фрагментация: сопоставление с библиотеками (MassBank, mzCloud, NIST (если GC‑MS), GNPS), поиск совпадений.In‑silico: MetFrag, SIRIUS/CSI:FingerID, CFM‑ID для предсказания фрагментов и ранжирования кандидатов.Сетевой анализ спектров (molecular networking, GNPS) — полезно для семейства родственных соединений (производные, метаболиты).Suspect screening: сравнить с базами известных водных загрязнителей (EPA CompTox, PubChem, SWISS‑Pesticides, DBP списки и пр.).Применить шкалу уверенности идентификации (Schymanski et al. 2014) — от 5 (точный масс‑пик) до 1 (структура подтверждена стандартом и 2+ orthogonal признаками).

Подтверждение структуры и NMR

Нужна изоляция/концентрация: preparative HPLC, фракционирование SPE, или солид‑phase elution для получения достаточного количества вещества.Количество: для 1H NMR обычно требуется ≥50‑500 μg (в зависимости от прибора/криопробы), для 13C и 2D обычно mg‑уровень; cryoprobe/microcoil уменьшают требования.NMR‑спектры: 1H, 13C, DEPT, HSQC, HMBC, COSY; DOSY помогает разделить компоненты по диффузии в смеси.Подтверждение: совпадение с эталоном по RT (GC/LC) и MS/MS плюс совпадающие NMR‑данные → уровень 1 (полная идентификация).Если недостаточно массы: синтезируйте/приобретите стандарт предполагаемого соединения и сравните RT и MS/MS.

Работа со смешанными/перекрывающимися спектрами

Хроматографическое улучшение/ортогональность:Меняйте колонку и подвижную фазу (RP ↔ HILIC, смена C18→Phenyl, использование гибридных фаз).GC×GC, длинные колонки или разные температурные программы.Фракционирование до анализа:Разделение SPE на фракции, флеш‑хроматография, preparative HPLC.Спектральная деконволюция:Для GC‑MS: AMDIS.Для LC‑MS: MS‑Dial, MZmine (алгоритмы для де‑изотопизации, де‑аддуктирования, связки MS/MS).Применять MCR‑ALS или PCA/ICA для отделения компонент в перекрывающихся спектрах (полезно при ИК или NMR).NMR в смеси:DOSY (разделение по D), селективные 1D‑TOCSY/NOESY для выделения spin‑систем; частотная селекция.Химические/энзиматические «тэги»:Дериватизация, селективная модификация функциональных групп (например, метилирование/силилирование), или ферментативное расщепление одного типа соединений, чтобы «избавиться» от одних и сохранить другие.Выделение по элементному признаку:Использование HRMS для поиска характерных изотопных паттернов (Cl, Br, S) чтобы разделить смеси.

Дополнительные инструменты и стратегии

Расчёт IR спектров (DFT) для кандидатов, сопоставление с экспериментальным ИК — помогает укрепить гипотезу о функциональных группах и структуры.Изотопное выражение/штрих‑марки (использование 13C/15N‑меток) редко применяется в рутинной водной аналитике, но может помочь в механистических исследованиях.При подозрении на производные/метаболиты – ищите массовые сдвиги (±16, ±14, ±176 и т.д.) и характерные фрагменты.Храните и используйте «in‑house» библиотеки MS/MS из спайков и стандартов.

Контроль качества и отчетность

Бланки, спайки, матричные стандарты.Отчёт с присвоением уровня уверенности (Schymanski 1–5).Указать LOD/LOQ, восстановление SPE, матричные эффекты (ионное угнетение/усиление).

Пример рабочего сценария (операционный план)
1) Собрать 5–10 л пробы, охладить.
2) SPE HLB (pH 2 и pH 10 отдельные пробы) → элюировать фракции (MeOH, DCM).
3) Анализ фракций:

Фракции в неполярном растворителе → GC‑MS (EI) + дериватизация полярных фракций.Полярные фракции → LC‑HRMS (ESI+/-) с DDA и DIA; MS/MS сбор.
4) Обработать данные: вычесть бланки, де‑аддукт/изотоп, формулы по точной массе, библиотечный поиск + in‑silico ранжирование.
5) Выделить наиболее вероятные кандидаты → preparative HPLC или концентрировать SPE для накопления массы.
6) Подтвердить NMR (1H/13C/2D). Если масса не достаточна — заказать или синтезировать стандарт и сравнить RT/MS/MS.
7) Документировать с уровнями уверенности.

Короткие практические советы

Всегда делайте бланки и матричные спайки, SPE recovery контроль.Параллельно запускать как положительные, так и отрицательные ионизационные режимы.Используйте orthogonal подтверждения: RT + точная масса + MS/MS + NMR (или стандарт).Применяйте шкалу Schymanski для прозрачности при отчётности.Не пренебрегайте дериватизацией — многие полярные примеси «скрыты» для GC без неё.

Если нужно, могу:

предложить конкретные параметры SPE/колонок/растворителей под предполагаемые классы соединений (пестициды, продукты хлорирования, фармацевтические следы);составить рабочую методику (SOP) с объёмами, растворителями, программами GC/LC и настройками MS;помочь с подбором программного обеспечения/баз данных и шаблона отчёта с уровнем уверенности.