Коротко — потому что ферменты специально «затрени-рованы» связывать субстрат и стабилизировать переходное состояние: это даёт сильное снижение энергии активации при нормальных температуре, pH и давлении и обеспечивает высокую селективность по субстрату и по стереохимии. Ниже — по пунктам с примерами и объяснением, как pH и мутации меняют Km и kcat и какие из этого следствия для метаболизма.

1) Почему ферменты работают при мягких биологических условиях с высокой селективностью

Специфичное связывание: активный центр образует набор ненковалентных взаимодействий $водородныесвязи,ионные,ван‑дер‑Ваальсовы,гидрофобные$, которые точно распознают форму, полярность и заряд субстрата → повышенная селективность.Индуцированное подстроение $inducedfit$: связывание вызывает конформационные изменения, которые оптимизируют размещение реагирующих групп и исключают воду.Стабилизация переходного состояния: фермент сильнее связывает переходное состояние, чем исходное состояние → понижает ΔG‡ и увеличивает скорость.Проксимити/оринтация: фермент «склеивает» реагенты и ориентирует их оптимально, что увеличивает эффективную концентрацию и ускоряет реакцию.Электростатическая среда и каталитические остатки $кислоты/основания,металл‑кофакторы$ создают локальные условия $например,локальнаякислотность,способностьпринимать/отдаватьпротон$, отличные от среды раствора.
Результат: большие ускорения $часто10^6–10^{1}2раз$ и высокая специфичность.

2) В чем смысл Km и kcat и как меняются

kcat $turnovernumber$ — число молекул продукта, образующихся за секунду на одном полностью активном молекулярном центре фермента $принасыщениисубстратом$.Km — концентрация субстрата при которой скорость равна половине Vmax; в простых схемах отражает комбинированную величину, близкую к диссоциационной константе комплексa ES $т.е.мерасродстваврамкахмеханизма$.Ключевая характеристика — каталитическая эффективность kcat/Km, важная когда $$S$$ << Km $линеарнаязависимостьскоростиотkcat/Km$.

3) Как изменение pH влияет на Km и kcat — механизмы и примеры

pH меняет степени протонирования каталитических остатков $His,Glu,Asp,Lys,Cys,Tyr$ и самого субстрата. Это может:
Изменить binding $Km$: если протонирование ключевого остатка нарушает водородные/ионные контакты, снижается сродство → Km повышается.Изменить kcat: если для катализа требуется определённая ионизационная форма $например,основание/кислотавактивномцентре$, её ионизация влияет на скорость превращения → kcat падает при уходе от оптимального pH.Типичный профиль активности — колоколообразная кривая: требуется, чтобы две $илиболее$ группы находились в нужных ионизационных состояниях, поэтому активность максимальна в промежуточном pH.Примеры:
Пепсин: оптимум ~pH 1–3 — кислотная среда позволяет каталитическим остаткам работать. При нейтральном pH активность почти исчезает.Трипсин/сериновые протеазы: оптимумы около pH 7–9; каталитическая триада $His—Asp—Ser$ зависит от правильной ионизации His. При сильной кислотности His протонирован и не может действовать как основание → kcat падает.Карбоангидраза: His64 действует как протонный шаттл; при низком pH он постоянно протонирован и kcat уменьшается.Лизоцим: две ключевые глутаминовые кислоты $Glu35,Asp52$ — оптимум около pH 5; изменение pH сдвигает их pKa и снижает активность.Практический эффект: изменение pH в органелле/тканях $например,лизосомыpH4.5$ активирует/деактивирует ферменты и служит механизмом компартментализации метаболизма.

4) Как мутации в активном центре влияют на Km и kcat — механизмы и примеры

Мутации меняют геометрию, электронику и гибкость активного центра:
Если мутация ухудшает связывание субстрата $например,удаленаH‑связьвкармане$, Km ↑ $снижениесродства$; если каталитическая способность остаётся, kcat может почти не измениться.Если мутация разрушает каталитическую функцию $удаляетсякислотно‑основнаягруппа,нуклеофилит.д.$, kcat ↓ резко $иногдананесколькопорядков$; Km может остаться близким, если связывание не нарушено.Если мутация одновременно ухудшает и связывание, и каталитическое действие — оба параметра меняются.Примеры:
Сериновые протеазы: замена кататического Ser→Ala резко уменьшает kcat $до10^6разилиболее$, потому что нуклеофильный активационный шаг исчезает; Km может измениться мало, если субстрат по‑прежнему сидит в кармане.Глюкокиназа $glucokinase$: активирующие мутации снижают Km $лучшеесвязывание$ и/или повышают kcat → повышенный гликозилированный поток, может приводить к гиперинсулинемии; инактивация $\uparrow Kmили\downarrow kcat$ даёт MODY $maturity‑onsetdiabetesoftheyoung$.Фенилаланин гидроксилаза $PAH$: многие мутации приводят к падению kcat или снижению стабильности фермента → накопление фенилаланина → фенилкетонурия $PKU$.Бета‑лактамазы / вирусные протеазы: точечные мутации изменяют Km и kcat для новых антибиотиков/ингибиторов, приводя к лекарственной устойчивости.Принципиальное различие: мутации, затрагивающие «binding» и «transition state stabilization», дают разные сигнатуры в Km и kcat. Это важно для интерпретации кинетики и проектирования лекарств.

5) Последствия для метаболизма

Изменение потока метаболических путей: по закону Майкла‑Ментен v = $kcat[E][S]$/$Km+[S]$, изменение Km или kcat меняет скорость при данной $$S$$ и, соответственно, поток $flux$ через путь.
Если $$S$$ << Km, скорость пропорциональна kcat/Km → изменения в kcat/Km критичны.Если $$S$$ >> Km, скорость ≈ kcat $$E$$ → изменение kcat $иликоличествафермента$ важнее.Регуляция и компартментализация: разный pH в органеллах $лизосомыvsцитозольvsмитохондрии$ позволяет иметь ферменты, активные лишь там.Болезни: потери активности $\downarrow kcatили\uparrow Km$ приводят к накоплению субстратов или дефициту продуктов $напр.,PKU,некоторыеформыдиабета,нарушенияметаболизмалипидов$. Активирующие мутации могут вызвать избыточную продукцию метаболитов $гиперурикемия,гиперинсулинемия$.Эволюция и лекарственная устойчивость: мутанты с изменёнными Km/kcat могут давать селективное преимущество $убеганиеотингибиторов,адаптациякновымсубстратам$.Фармакология: изменение Km/ kcat у мишени или у метаболизирующих ферментов меняет фармакокинетику/терапевтический эффект лекарств.

6) Практическая интерпретация для экспериментатора/врача

При анализе мутации важно измерять оба параметра $Kmиkcat$. Резкое падение kcat при неизменном Km → катализсложность; рост Km при неизменном kcat → нарушение связывания.Изменение pH при эксперименте может радикально поменять выводы — всегда учитывать ионизационные состояния остатков и субстрата.

Короткое резюме:
Ферменты достигают высокой скорости и селективности за счёт точного связывания и стабилизации переходного состояния при мягких условиях. pH и мутации меняют ионизационные состояния и структуру активного центра — это отражается на Km $сродство$ и kcat $скоростькаталитическогошага$. В живой клетке такие изменения меняют поток метаболизма и могут вести к адаптации или к заболеваниям.