Кратко — принцип и следствия.
1) Что определяет кислотно‑основное поведение
- Ионогенность резидуа определяется химией боковой цепи: карбоксилы (Asp, Glu) — кислотные, аминогруппы (Lys, Arg, N‑термин) — основные, гистидин — слабое основание, тиол и фенол — умеренно «кислые».
- Типичные «вакцинальные» pKa в свободных пептидах/аминокислотах (приближённо): Asp $\sim 3.9$, Glu $\sim 4.2$, His $\sim 6.0$, Cys $\sim 8.3$, Tyr $\sim 10.1$, Lys $\sim 10.5$, Arg $\sim 12.5$. Концевые группы: C‑term $\sim 2.9\text{–}3.6$, N‑term $\sim 8.0\text{–}9.5$. В белках эти значения могут сдвигаться на несколько единиц pH.
2) Как строение и модификации боковой цепи меняют pKa
- Электронные эффекты: индуктивное оттягивание электронов (электроотрицательные группы рядом) стабилизирует отрицательный заряд и понижает pKa кислой группы; донорные заместители повышают pKa.
- Резонанс/делокализация: карбоксилат стабилен → низкий pKa; амидная связь (например ацетилирование Lys превращает амин в амид) делает группу практически непро­тонируемой (pKa сильно понижен).
- Сольовые взаимодействия и водородные связи: окружение, которое стабилизирует протонированную форму, повышает pKa; стабилизация депротонированной — понижает.
- Десолвация/погружение в гидрофобную среду: уменьшение диэлектрической проницаемости повышает энергию заряженной формы → сдвиг pKa (часто на несколько единиц).
- Конформационные/стереоаналитические эффекты: напряжение или ограничение доступности влияет на способность отдавать/принимать протон.
- Ковалентные модификации:
- Фосфорилирование (Ser/Thr/Tyr) добавляет фосфат с pKa2 около $\sim 6\text{–}7$ → при физиологическом pH превращается в отрицательно заряженную группу.
- Ацетилирование Lys превращает амин в амид → потеря положительного заряда при физиологическом pH.
- Метилирование аминов меняет электронную плотность и способность к H‑связям; обычно смещает pKa и уменьшает способность к образованию солевых мостов (эффект зависит от степени метилирования).
- Сульфонирование/сульфатирование и др. также вводят отрицательный заряд.
3) Количественные формулы (важно при расчётах)
- Уравнение Хендерсона—Хассельбаха для кислотной группы HA:
$$\mathrm{pH}=\mathrm{p}{K}_a+\log \frac{[{\mathrm{A}}^{-}]}{[\mathrm{HA}]}$$ - Доля протонированной формы для кислоты:
$${\alpha }_{\mathrm{HA}}=\frac{1}{1+10^{\mathrm{pH}-\mathrm{p}{K}_a}}$$ (аналогично для основания $B$ доля протонированного $B{H}^{+}$ — та же формула с соответствующим $\mathrm{p}{K}_a$).
Примеры: при pH $7.0$ - Asp: ${\alpha }_{\mathrm{HA}}=\frac{1}{1+10^{7.0-3.9}}\approx 8\times 10^{-4}$ (почти полностью депротонирован).
- His: ${\alpha }_{\mathrm{HA}}=\frac{1}{1+10^{7.0-6.0}}\approx 0.091$ (ок. $9\%$ протонирован).
4) Практическое использование в методах разделения и анализа белков
- Изоэлектрическое фокусирование (IEF): pI белка определяется суммой вкладов боковых цепей; модификации (фосфорилирование, ацетилирование) сдвигают pI и позволяют разделять варианты (charge variants).
- Ионообменная хроматография (IEX): при pH выше pI белок несёт отрицательный заряд → на анионообменник; при pH ниже pI — положительный → на катионообменник. Управление pH и силой ионов позволяет селективно элюировать белки, влияя на степень протонирования боковых групп.
- Капиллярная электрофорез и нативный PAGE: разделение по заряду/соотношению заряд/масса; pH буфера контролирует протонирование боковых цепей и, следовательно, подвижность.
- Мас‑спектрометрия (ESI): распределение степеней заряда субъекта зависит от числа и pKa основных остатков (Lys, Arg, His) и от протонирования в растворе/вспрыске.
- Аффинные взаимодействия и связывание металлов: например, связывание металлов His требует его депротонирования/координации; pH‑регулирование влияет на связывание.
- Аналитика модификаций: изменение массы + изменение заряда (фосфорилирование, ацетилирование) используют в 2D‑электрофорезе и LC–MS для обнаружения и разделения изоформ.
Короткое резюме: строение боковой цепи определяет исходный pKa и способность к протонированию; локальная среда и ковалентные модификации могут сдвигать pKa на несколько единиц, меняя заряд при физиологических pH. Эти изменения прямо используются в IEF, ионообменной хроматографии, электрофорезе и MS для разделения и анализа белков.