Кратко, но с ключевыми формулами и объяснениями.
Вступление — масштаб ускорения
- Катализ ферментов даёт ускорение порядка $10^6$–$10^{12}$ по сравнению с некатализируемой реакцией. Это эквивалентно снижению барьера активации на несколько килокалорий: при $T=298\text{K}$ (\(RT\approx 0.593\ \text{kcal·mol}^{-1}\))
$$\Delta \Delta G^{‡}=-RT\ln \left(\frac{k_{\text{cat}}}{k_{\text{uncat}}}\right),$$ для $\frac{k_{\text{cat}}}{k_{\text{uncat}}}=10^6$ получаем \(\Delta\Delta G^\ddagger\approx -8.2\ \text{kcal·mol}^{-1}\), для $10^{12}$ — \(\approx -16.4\ \text{kcal·mol}^{-1}\).
Основные механистические принципы катализа
- Снижение свободной энергии активации: по Eyring
$$k=\frac{k_{B}T}{h}{e}^{-\Delta G^{‡}/RT},$$ фермент стабилизирует переходное состояние, уменьшая $\Delta G^{‡}$.
- Селективная стабилизация переходного состояния: фермент связывает TS сильнее, чем субстрат — основа высокого каталитического усилия.
- Проксимити/ориентация и снижение энтропийного штрафа: правильное расположение реагентов внутри активного центра повышает эффективную молярность и вероятность реакции.
- Электростатическая предорганизация: фиксированные заряды/полярные группы в активном центре лучше стабилизируют заряженные TS, чем растворитель.
- Индуцированный подгон (induced fit) и динамика: структурные изменения оптимизируют контакт с TS.
- Металло-катализ: ионы стабилизируют заряды, активируют воду/нуклеофилы или участвуют в окислительно-восстановительных шагах.
- Квантовый туннелинг (особенно при переносе H): может дополнительно увеличивать скорость для лёгких частиц.
Роль переходного состояния
- Ключевая идея: каталитическая эффективность пропорциональна тому, насколько фермент снижает $\Delta G^{‡}$ для переходного состояния. Ингибиторы-аналоги переходного состояния часто чрезвычайно сильны, поскольку имитируют наиболее стабилизированную форму, к которой «приспособлен» активный центр.
Кислотно‑основная каталитическая стратегия
- Общая идея: перенос протонов в ходе реакции стабилизирует заряды в TS и облегчает образование/разрыв связей.
- Типы:
- Общая кислота/основание: аминокислоты (например, His, Glu, Asp, Lys, Cys, Tyr) временно принимают или отдают протон, ускоряя переход. Пример: His принимает H+ от нуклеофила (делает его более нуклеофильным) или отдаёт H+ уходящей группе.
- Генерация сильных нуклеофилов/ослабление уходящих групп через протонирование/депротонирование.
- Зависимость от pH:
- Анализируется через pKa катализирующих групп: их протонированное/непротонированное состояние должно быть подходящим. Доля де-протонированной формы:
$$f=\frac{1}{1+10^{\mathrm{p}{K}_a-\mathrm{pH}}}.$$ - Если для активности нужны две группы с разными зарядами, профиль скорости по pH часто «колоколообразный», и его можно аппроксимировать произведением долей:
$$f(\text{active})=\frac{1}{1+10^{\mathrm{p}{K}_{a1}-\mathrm{pH}}}\cdot \frac{1}{1+10^{\mathrm{pH}-\mathrm{p}{K}_{a2}}}.$$
Ковалентная каталитическая стратегия
- Фермент формирует короткоживущий (ковалентный) промежуточный комплекс с субстратом (например, ацил‑фермент при сериновой протеазе).
- Кинетическая схема:
$$E+S\underset{k_{-1}}{\overset{k_1}{}}ES\stackrel{k_2}{}E-I\stackrel{k_3}{}E+P,$$ где $E-I$ — ковалентный промежуточный комплекс.
- Преимущества: изменяется механизм реакции (часто двухступенчатый), уменьшаются энергетические барьеры для отдельных шагов, облегчён уход группы/образование продуктов.
- Типичные нуклеофилы: Ser, Cys, Lys; часто сочетается с кислотно‑основной катализой (каталитический триад: Ser-His-Asp).
Влияние изменения pH
- pH меняет протонирование каталитических остатков и субстрата → меняются k_cat, K_M и профиль активности.
- Смещение pH может:
- Снизить активность, если нужная форма остатка исчезает.
- Изменить механизм (например, при высокой/низкой кислотности меняется роль основания/кислоты).
- Практически: измерение pH–rate кривых даёт pKa важных групп и указывает, какие состояния необходимы для катализа.
Влияние мутаций
- Мутация каталитического остатка (например, His→Ala, Ser→Ala) обычно резко снижает скорость (иногда на $10^3$–$10^8$ и больше), потому что теряется прямая роль в стабилизации TS или в химическом шаге.
- Изменения геометрии/электростатики: мутации, удаляющие заряд/полярность в активном центре, ухудшают электростатическую стабилизацию TS.
- Сдвиг pKa соседних остатков: замена аминокислоты может изменить локальную среду и тем самым сместить pKa, меняя pH‑профиль активности.
- Количественная связь: изменение высоты барьера из изменения скорости
$$\Delta \Delta G^{‡}=-RT\ln \left(\frac{k_{\text{mut}}}{k_{\text{wt}}}\right).$$ Пример: уменьшение скорости в $10^3$ соответствует \(\Delta\Delta G^\ddagger\approx 0.593\cdot\ln(10^{3})\approx 4.1\ \text{kcal·mol}^{-1}\).
- Мутации могут также влиять на динамику, на способность фермента «примерить» переходное состояние, не только на прямую химию.
Экспериментальные последствия и доказательства
- Сильные ингибиторы‑аналогии переходного состояния подтверждают идею стабилизации TS.
- Кинетика по pH, site‑directed мутации, кинетические изотопные эффекты, структурные данные и расчёты электростатики дают комплементарные доказательства механизмов.
Короткий вывод
- Ферменты достигают огромных ускорений главным образом за счёт селективной стабилизации переходного состояния (снижения $\Delta G^{‡}$), оптимальной ориентации реагентов, электростатической предорганизации и химических стратегий — кислотно‑основной, ковалентной и метало‑каталитической. pH и мутации меняют протонирование, геометрию и электро‑статическую среду активного центра, что прямо отражается на скорости через изменение $\Delta G^{‡}$.