Кратко и по делу — как уровни структуры обуславливают каталитическую активность (на примере сериновой протеазы — трипсина/химотрипсина) и как дистантные мутации её меняют.
1) Первичная структура
- Последовательность аминокислот определяет наличие каталитических остатков (триплет/триада: Ser195, His57, Asp102 в нумеровке хемотрипсина).
- Замена одной аминокислоты может удалить или изменить нуклеофил/кислото-основной центр и тем самым полностью нарушить катализ.
2) Вторичная структура
- Спирали и бета-листы формируют каркас, который позиционирует боковые группы. В сериновых протеазах активный центр формируется на стыке бета-структур и петлей.
- Например, петли образуют S1-полость (специфичность), а короткие сегменты образуют «оксанионовую яму» (NH группами основной цепи), стабилизирующую тетраэдрический промежуточный состояние.
3) Третичная структура (ключевая для катализа)
- Фолдинг «собирает» удалённые по последовательности остатки в строгую трёхмерную геометрию: Ser–His–Asp формируют водородные связи, обеспечивающие протонный перенос и активацию Ser-Oγ как нуклеофила.
- Геометрия активного центра и электростатическая предорганизация определяют энергетику переходного состояния — от этого зависят $k_{cat}$ и $K_m$.
- Пример: механизм сериновой протеазы — нуклеофильная атака Ser195 → образование тетраэдрического интермедиата, стабилизируемого оксанионовой ямой; His57 действует как базовый/кислотный посредник, Asp102 стабилизирует положительный заряд His.
4) Количественная связь со скоростью
- Микелианская кинетика: $v=\frac{V_{\max }[S]}{K_m+[S]}$, где $V_{\max }=k_{cat}[E{]}_0$.
- Каталитическая эффективность часто характеризуется отношением $\frac{k_{cat}}{K_m}$.
- Изменение скорости связано с изменением энергии активации: $k=A{e}^{-\Delta G^{‡}/RT}$, поэтому переход от $k_{wt}$ к $k_{mut}$ даёт $\Delta \Delta G^{‡}=-RT\ln \left(\frac{k_{mut}}{k_{wt}}\right)$.
5) Как дистантные (вне активного центра) мутации влияют на активность
- Сдвиг третичной структуры: даже одиночная замена на поверхности может изменить положение петель, формирующих S1-полость или оксанионовую яму, нарушив точную геометрию катализирующих остатков.
- Изменение динамики и флексибильности: удалённая мутация может изменить подвижность участков, нужных для связывания субстрата или стабилизации переходного состояния; это меняет $k_{cat}$ и/или $K_m$.
- Электростатические и pKa-эффекты: перестройка водородных сетей и диполей может сменить pKa His57 → меняется доля активной протонированной/де-протонированной формы и скорость протонного переноса.
- Аллостерия и связанная конформационная смена: мутация может смещать равновесие между конформациями (активной/неактивной), меняя доступность активного сайта.
- Стабильность фермента: снижение термостабильности может приводить к частичной денатурации и снижению активного [E]0.
6) Конкретный пример и типичный эффект
- Остаток Asp189 в S1-полости трипсина даёт отрицательный заряд и определяет специфику на лизин/аргинин; замена Asp189 на нейтральный остаток (например, Ser) изменит предпочтение субстрата (приближение к специфичности химотрипсина).
- Дистантные мутации, не затрагивающие активные остатки, могут уменьшить каталитическую эффективность на несколько порядков; это эквивалентно увеличению $\Delta \Delta G^{‡}$ на несколько $RT$ (по формуле выше).
Краткий вывод: первичная задаёт «набор инструментов», вторичная — локальную архитектуру, третичная — точную топологию и электростатику активного центра; дистантные мутации действуют через изменение геометрии, динамики, электростатики или равновесий конформаций и потому могут существенно менять $k_{cat}$, $K_m$ и $\frac{k_{cat}}{K_m}$.