Возможные механизмы ингибирования и какие эксперименты их различат (кратко, с ожидаемыми признаками).
1) Сейвестрация субстрата: образование неактивного комплекса $A+C\rightleftharpoons AC$, который не даёт B.
- Модель: пусть $K=[AC]/([A][C])$. Доля свободного $A$: $[A{]}_{free}=[A{]}_{tot}/(1+K[C])$. Скорость: $v=k[A{]}_{free}=k\frac{[A{]}_{tot}}{1+K[C]}$.
- Отличие в опытах: при увеличении $[A{]}_{tot}$ эффект ингибирования ослабляет (биндинг насыщается); линейная зависимость $1/(1+K[C])$. Нахождение комплекса в NMR/UV (новые сигналы), MS (аддукт $AC$).
2) Блокирование/подавление катализатора (адсорбция или отравление): $C$ связывается с поверхностью катализатора или реагентом (химическое связывание/окисление), уменьшая число активных центров.
- Признак: добавление лишнего катализатора восстанавливает скорость; прединкубация катализатора с $C$ снижает активность навсегда; смена поверхности/материала изменяет эффект.
- Эксперименты: предобработка катализатора с $C$ и последующая промывка; XPS/IR для обнаружения связанного $C$; измерение активности после удаления $C$; ICP-MS для оценки вымывания/изменения состава.
3) Квентирование реактивного промежуточного звена (радикал/карбокатион/нуклеофил): $C$ быстро реагирует с активным промежуточным $I$, уводя его в неактивный путь.
- Модель (радикальный случай, стационарное приближение): $[I]\approx \frac{k_{form}[A]}{k_{cons}+k_c[C]}$, и $v\propto [I]$, т.е. $v$ падает с $[C]$ как $1/(1+\alpha [C])$.
- Отличие: появление продукт-аддуктов $I-C$ (MS, LC); EPR/радикальные зонды показывают уменьшение сигнала; добавление радикального инициатора может частично восстановить скорость; радикальные часы/скопы.
4) Конкуренция за активный центр (аналог конкурентного ингибирования): $C$ конкурирует с $A$ за один и тот же сайт (особенно в гомогенном каталитическом или ферментном механизме).
- Признак: при увеличении $[A]$ эффект подавления ослабевает; Vmax остаётся прежним, а «Km» возрастает (в терминах Михаэлиса–Ментен).
- Эксперимент: измерить начальные скорости при разных $[A]$ и $[C]$; построить Лайнвивер–Бёрк или аналог и увидеть изменение «Km» без изменения Vmax.
5) Некомпетитивное/ункомпетитивное связывание (C связывается с комплексом каталитически активного состояния или только с комплексом E·A)
- Признак: изменение Vmax (уменьшение) с/без изменения Km (зависит от типа). Для неконкурентного: Km неизменен, Vmax уменьшается. Для ункомпетитивного: и Km, и Vmax уменьшаются пропорционально.
- Эксперимент: кинетика при разных $[A]$ и $[C]$ с анализом по MM-формуле.
6) Изменение среды (pH, диэлектрич., ионная сила, создание микроколлоидов): даже малые концентрации полярных/ионизующих примесей могут менять скорость.
- Признак: зависимость от буфера/солёности/растворителя; эффект может исчезнуть при буферизации pH или смене растворителя; DLS показывает образование частиц.
- Эксперимент: повтор в буферах разного pH/проводимости; DLS/турбидиметрия; смена растворителя.
7) Окисление/восстановление реагентов или катализатора (редокс-побочный путь): $C$ окисляет или редуцирует активный вид катализатора.
- Признак: изменение окислительного состояния (UV-Vis, EPR); добавление восстановителя/окислителя меняет эффект.
- Эксперимент: спектроскопия окс. состояний до/после; восстановление катализа химическим восстановителем.
Рекомендованные шаги для различения механизмов (порядок действий):
- Кинетика начальных скоростей: измерить $v_0$ при наборе $[A]$ и при нескольких фиксированных $[C]$. Проанализировать, меняются ли Vmax и Km (или эквиваленты) — это быстро разделяет конкурентный/неконкурентный/ункомпетитивный механизмы.
- Зависимость скорости от $[C]$ при фиксированном $[A]$: проверьте линейность/насыщение; для связи $A+C$ ожидается $v\propto 1/(1+K[C])$.
- Прединкубация и прерывные опыты: прединкубация каталитической системы с $C$ и последующее удаление/промывание — различает обратимые комплексы и необратимое отравление.
- Спектроскопия/анализ продуктов: NMR, UV-Vis, EPR, LC–MS для поиска комплексов $AC$, аддуктов $I-C$ или изменения катализатора.
- Радикальные тесты: радикальные зонды/инициаторы, EPR и радикальные часы.
- Физико-химические тесты: DLS/турбидность (коллоиды), pH/буферирование, изменение растворителя.
- Температурная зависимость: сравнить $\Delta H^{‡},\Delta S^{‡}$ с/без $C$; разные механизмы дают разные изменения активационных параметров.
- Вспомогательные: добавление избытка катализатора или субстрата, изотопный эффект (KIE) если подозревается изменение шага переноса протона.
Коротко: сначала кинетический анализ (v0 vs [A] при нескольких [C]) и наблюдение за восстановлением при избытке A или катализатора; затем целевые спектроскопические и аддукционные эксперименты (NMR/LC–MS, EPR, XPS, DLS, pH), чтобы подтвердить конкретную молекулярную причину.