Коротко: активный центр каталазы (гем, образование промежуточного «compound I», перенос электронов/протонов) задаёт химическую часть механизма; кинетические параметры (особенно величина $k_{\text{cat}}/K_M$) показывают, ограничивает ли скорость сама химическая конверсия или диффузия подачи H${}_2$O${}_2$ к центру. Ниже — набор экспериментов и ожидаемые результаты, которые позволяют отличить диффузионно управляемый механизм от механизма с преобладающей химической стадией.
Короткие уравнения для ориентира:
- Михаэлис–Ментен: $$v=\frac{k_{\text{cat}}[E][S]}{K_M+[S]}.$$ - При $[S]\ll K_M$: $$v\approx \frac{k_{\text{cat}}}{K_M}[E][S],$$ поэтому $k_{\text{cat}}/K_M$ — вторичный порядковый констант эффективности связывания/реакции.
- Порог диффузии: $$k_{\text{diff}}\sim 10^8-10^9{\mathrm{M}}^{-1}{\mathrm{s}}^{-1}$$ (приблизительно).
1) Измерение $k_{\text{cat}}$ и $K_M$ (линейная часть при низких [S])
- Метод: классические начальные скорости при разных [H${}_2$O${}_2$] и аппроксимация Михаэлиса–Ментена; при низких [S] определяют наклон $\frac{v}{[E][S]}=k_{\text{cat}}/K_M$.
- Интерпретация: если $k_{\text{cat}}/K_M$ близко к $10^8-10^9{\mathrm{M}}^{-1}{\mathrm{s}}^{-1}$ — скорее диффузионно ограничено; существенно меньше — химическая стадия вероятно лимитирует.
2) Зависимость от вязкости раствора
- Метод: добавление глицерола/сорбитола для варьирования вязкости $\eta$; измеряют $k_{\text{cat}}/K_M$ или начальные скорости.
- Ожидаемо:
- Диффузионный контроль: скорость пропорциональна диффузии $D\propto 1/\eta$ → $k_{\text{obs}}\propto 1/\eta$.
- Химический контроль: слабая или отсутствующая зависимость на $\eta$.
- Формула для проверки: при чистом диффузионном контроле $$k\propto \frac{1}{\eta }.$$
3) Температурная зависимость (Аррениус)
- Метод: измерения скоростей при разных температурах, построить $\ln k$ vs $1/T$.
- Интерпретация:
- Диффузионное ограничение: малая эффективная энергия активации $E_a$ (очень слабая Т‑зависимость).
- Химическое ограничение: значительный $E_a$, линейный Аррениус‑плот с ощутимым наклоном.
- Уравнение: $$k=A\exp \left(-\frac{E_a}{RT}\right).$$
4) Предустановленная кинетика (stopped‑flow / rapid‑mixing) и спектроскопия промежуточов
- Метод: быстрый смеш в стоп‑флоу, мониторинг спектра Soret (образование и распад compound I) и фаз пред‑установки (burst).
- Интерпретация:
- Если при смешении видно очень быстрый фазовый переход (образование комплекса) и затем медленное распадение — химическая стадия лимитирующая.
- Если образование комплекс/intermediate ~ предел разрешения (очень быстро) и отсутствие замедленного химического шага — возможно диффузионное ограничение.
- Burst‑фаза: наличие «burst» (быстрая фаза, затем медленная устойчивого потока) указывает на медленный химический шаг после быстрого связывания.
5) Изотопные эффекты растворителя и основной изотопный эффект
- Метод: сравнить скорости в H${}_2$O и D${}_2$O; также применить пероксид с метки (если релевантно).
- Интерпретация:
- Значительный растворительный KIE ($k_H/k_D>1.5$–2) указывает на участие переноса протона в лимитирующей химической стадии.
- Диффузионно‑ограниченная скорость даёт малый KIE.
6) Изменение ионной силы и зарядовых условий
- Метод: варьировать ионную силу; если субстрат/активный сайт заряжены, диффузия и электростатическое притяжение влияют.
- Интерпретация: значимая зависимость на ионную силу поддерживает влияние диффузии/предконцентрации.
7) Изменения активности при мутациях/ингибиторах активного центра
- Метод: site‑directed mutagenesis (замены остатков, участвующих в каталитическом переносе) или введение конкурирующих лигандов; измерить $k_{\text{cat}}$, $K_M$ и предустановочную кинетику.
- Интерпретация:
- Если изменение активного центра снижает $k_{\text{cat}}$ (или увеличивает $E_a$) без изменения параметров, связанных с диффузией (например, без изменения чувствительности к вязкости) — химическая стадия становится лимитирующей.
- Если мутация не влияет на $k_{\text{cat}}/K_M$, но влияет на связывание, можно отделить вклад процессов.
8) Оценка константы образования комплексa (k_on) напрямую
- Метод: stopped‑flow мониторинг образования compound I; кинетический анализ даёт $k_{\text{on}}$ и $k_{\text{off}}$.
- Интерпретация: если $k_{\text{on}}$≈$10^8-10^9{\mathrm{M}}^{-1}{\mathrm{s}}^{-1}$ — диффузионный предел; если $k_{\text{on}}$ значительно ниже — химическое ограничение связывания/реакции.
Практическая последовательность тестов (рекомендация)
1. Измерить $k_{\text{cat}}$ и $K_M$ → получить $k_{\text{cat}}/K_M$ и сравнить с диффузионным пределом.
2. Варьировать вязкость; проверка зависимости $k\propto 1/\eta$.
3. Stopped‑flow спектроскопия для регистрации compound I и пред‑установочных фаз.
4. Температурные и изотопные измерения для определения $E_a$ и KIE.
5. Доп. мутации/ингибиторы и изменение ионной силы для подтверждения природы лимитации.
Коротко о каталазной механистике: каталаза действует через двухступенчатый цикл с образованием compound I (ping‑pong‑тип), поэтому целесообразно прямо фиксировать кинетику образования/распада intermediate — это наиболее прямой способ отделить кинетику химических шагов от диффузионной подачи H${}_2$O${}_2$.
Если нужно — могу предложить протоколы измерений (концентрации, диапазоны вязкости, метод обработки данных) для конкретной лабораторной установки.