Кратко и по делу.
Физическая модель активного центра:
- Конкурентный ингибитор (I) — связывается в активном центре, конкурируя с субстратом (S); образует комплекс $E-I$, не дающий катализа. При высоком $[S]$ субстрат вытесняет ингибитор.
- Неконкурентный (чисто неконкурентный, обратимый) ингибитор — связывается в аллостерическом участке как с свободным ферментом $E$, так и с комплексом $ES$, уменьшая каталитическую активность (kcat) независимо от связывания субстрата; сродство к $E$ и $ES$ одинаково, поэтому связывание не мешает связыванию субстрата, но снижает Vmax.
Кинетика Михаэлиса–Ментен (формулы):
- Без ингибитора: $v=\frac{V_{\max }[S]}{K_M+[S]}$.
- Конкурентное ингибирование: эффект сводится к увеличению $K_M$: $K_{M,\text{app}}=K_M(1+\frac{[I]}{K_i})$, и
$v=\frac{V_{\max }[S]}{K_M(1+\frac{[I]}{K_i})+[S]}$.
В Lineweaver–Burk: $\frac{1}{v}=\frac{K_M}{V_{\max }}(1+\frac{[I]}{K_i})\frac{1}{[S]}+\frac{1}{V_{\max }}$.
Следствие: $V_{\max }$ неизменен, $K_M$ растёт.
- Чисто неконкурентное (обратимое) ингибирование: эффект — снижение $V_{\max }$ при неизменном $K_M$:
$V_{\max ,\text{app}}=\frac{V_{\max }}{1+\frac{[I]}{K_i}},K_{M,\text{app}}=K_M$,
$v=\frac{V_{\max }/(1+[I]/K_i)[S]}{K_M+[S]}$.
Lineweaver–Burk: $\frac{1}{v}=\frac{K_M}{V_{\max }}\frac{1}{[S]}+\frac{1+[I]/K_i}{V_{\max }}$.
Следствие: $K_M$ остаётся, $V_{\max }$ падает.
Какие экспериментальные данные отличают механизмы:
- Серии кинетических кривых $v([S])$ при нескольких фиксированных $[I]$. По поведению $V_{\max }$ и $K_M$:
- если $V_{\max }$ не меняется, а $K_M$ увеличивается → конкурентное;
- если $V_{\max }$ уменьшается, а $K_M$ не меняется → чисто неконкурентное.
- Lineweaver–Burk (двойной обратный) график:
- конкурентное — прямые пересекаются на оси ординат (одинаковый $1/V_{\max }$);
- неконкурентное — прямые пересекаются на оси абсцисс (одинаковый $-1/K_M$).
- Проверка функционально: при очень больших $[S]$ конкурентный ингибитор теряет эффект (восстановление скорости), у неконкурентного эффект остаётся.
- Доп. методы: кинетика останов‑потока/предшествующие состояния для обнаружения связывания с $ES$; конкурентные связывающие анализы (SPR, ITC), кристаллография или NMR для локализации места связывания; измерение образования комплекса $ESI$.
Применение в разработке лекарств:
- Выбор механизма зависит от биологии целевого процесса:
- конкурентные ингибиторы полезны, если активный сайт уникален и клинически достижимо превысить $[S]$ конкуренцией; требуют высокой аффинности и селективности к активному центру.
- аллостерические/неконкурентные ингибиторы выгодны, когда субстрат высококонцентрационный или активный сайт консервативен (затруднена селективность); позволяют модулировать kcat, часто дают изофермент‑специфичность и меньшую зависимость от концентрации субстрата.
- Для оптимизации лекарства важно измерять $K_i$, константы on/off, и проверять поведение при физиологических $[S]$; также учитывать возможность смешанного ингибирования (меняются и $K_M$, и $V_{\max }$) и переносимость/селективность, подтверждаемую структурными и клеточными тестами.
Вывод: отличить механизмы можно простыми кинетическими экспериментами (серии $[S]$ при разных $[I]$) и подтверждать биофизическими/структурными методами; выбор механизма определяет стратегию дизайна и требования к аффинности и селективности препарата.