Кратко — вероятный механизм: перекись водорода окисляет люциферин (или его производное) с образованием возбуждённого оксилюциферина (или другого возбуждённого продукта), который при переходе в основное состояние испускает фотон. Неферментативно этот процесс обычно идёт через радикальные и/или пероксидные промежуточные стадии, часто катализируемые металлами или перекисными/пероксидазными системами.
Ключевые шаги (упрощённо):
- инициирование (формирование радикалов или активного кислородного вида), напр. Fenton-тип:
${\mathrm{H}}_2{\mathrm{O}}_2+\mathrm{F}{\mathrm{e}}^{2+}\to \mathrm{F}{\mathrm{e}}^{3+}+\mathrm{O}{\mathrm{H}}^{-}+\cdot \mathrm{OH}$ - перенос/атакa на люциферин:
$\mathrm{Luc}+\cdot \mathrm{OH}\to \mathrm{Luc}\cdot +{\mathrm{H}}_2\mathrm{O}$ - образование возбуждённого продукта (окси‑/перокси‑производного):
$\mathrm{Luc}\cdot +{\mathrm{O}}_2\to \mathrm{oxLu}{\mathrm{c}}^{\ast }+...$ - свечение:
$\mathrm{oxLu}{\mathrm{c}}^{\ast }\to \mathrm{oxLuc}+\mathrm{h}\nu$
Возможные промежуточные радикалы/виды: $\cdot OH$ (гидроксил), $\cdot O_2^{-}$ (супероксид), ${}^1{\mathrm{O}}_2$ (синглетный кислород), пероксильные/алкильные радикалы ($\mathrm{ROO}\cdot$, $\mathrm{RO}\cdot$), а также радикал-анион люциферина ($\mathrm{Luc}{\cdot }^{-}$ или $\mathrm{Luc}\cdot$).
Как определить участвующие радикалы — рекомендуемые эксперименты и индикаторы (контрольный план):
1. Спектр и кинетика свечения
- Измерить спектр эмиссии: люциферин/жук‑люциферин даёт ~$\sim 560\text{нм}$ (в биологическом контексте), люминол — ~$\sim 425\text{нм}$. Совпадение спектра с известным указывает на природу возбужденного эмиттера.
- Временная кривая (быстрая вспышка vs длительное свечение) даёт подсказку об механизме.
2. Кислородный/изотопный трейс
- Провести в анаэробных условиях или с обогащённым ${}^{18}\mathrm{O}$ (H${}_2^{18}$O или ${}^{18}{\mathrm{O}}_2$) и проанализировать включение кислорода в продукт (МС) — выяснит источник кислорода в оксипродукте.
3. Использование специфичных «глушителей» (скейвенджеров)
- Каталаза: растворение H${}_2$O${}_2$ — если свечение исчезает, ключевой ролью является сама H${}_2$O${}_2$: $2{\mathrm{H}}_2{\mathrm{O}}_2\stackrel{\mathrm{catalase}}{}2{\mathrm{H}}_2\mathrm{O}+{\mathrm{O}}_2$.
- Маннитол или $t$-бутанол — ловушки для $\cdot OH$. Ослабление свечения указывает на роль $\cdot OH$.
- Супероксиддисмутаза (SOD) — улавливает $\cdot O_2^{-}$; уменьшение свечения говорит о роли супероксида.
- Азид натрия (${\mathrm{N}}_3^{-}$), гистидин, DABCO — ловушки/кворчеры для синглетного кислорода ${}^1{\mathrm{O}}_2$.
- Добавление хелаторов металлов (EDTA, DTPA, deferoxamine) — если свечение падает, вероятен Fenton‑катализ (Fe/Cu).
- Блокаторы пероксидаз (NaN${}_3$ как ингибитор пероксидаз) — проверка ферментативного участия.
4. EPR (ЭПР) со спин‑ловушками
- Использовать DMPO, PBN, DEPMPO и т.п. для захвата $\cdot OH$, $\cdot O_2^{-}$ и идентификации по спектрам ЭПР. Это наиболее прямой метод для радикалов.
- Для синглетного кислорода — применяют TEMP → TEMP‑${}^1{\mathrm{O}}_2$ адипт, обнаруживаемый ЭПР.
5. Хроматография/масс‑спектрометрия продуктов
- Поиск продуктов окисления люциферина (оксилюциферин и др.), определение их массовых сдвигов при ${}^{18}\mathrm{O}$-метках.
6. Влияние ферментов/ферментативное сравнение
- Добавление люциферазы и ATP как положительный контроль биолюминесценции; сравнить спектр/квантовый выход с неферментативным процессом.
7. Квантовый выход и энергетика
- Оценить эффективность свечения и сравнить с теоретической энергией перехода: $\mathrm{E}=\mathrm{h}\nu$, где $\mathrm{h}\nu$ соответствует измеренной длине волны.
Практическая последовательность (коротко)
- Базовые контроли: H${}_2$O${}_2$ один; люциферин один; смесь.
- Добавлять по очереди: каталаза, SOD, маннитол/т‑бутанол, NaN${}_3$/гистидин, хелаторы — смотреть изменение интенсивности/кинетики.
- Параллельно сделать ЭПР со спин‑ловушкой и МС продуктов; при необходимости — эксперименты с ${}^{18}\mathrm{O}$.
Итог: сочетание ингибиторов/ловушек (функциональные тесты) + ЭПР со спин‑ловушками + МС/изотопный трекинг + спектр свечения и кинетика даст надёжное определение, какие радикалы и какие механистические пути участвуют.