Коротко — перечисление методов и критерии выбора при эпидемии.
Какие молекулярные методы можно использовать
- RT‑qPCR (реального времени) — «золотой стандарт» для выявления РНК‑вирусов: высокая чувствительность/специфичность, количественная оценка вирусной нагрузки, пригодна для массового тестирования. LOD обычно порядка $10^1$–$10^3$ копий/мл в зависимости от протокола.
- Ценральная/конвенциональная ПЦР (endpoint PCR) — дешёвая, требует гель/электрофореза; используется при ограниченных ресурсах или для подтверждения.
- Цифровая ПЦР (dPCR) — абсолютная квантфикация, высокая чувствительность при низкой нагрузке; LOD ~$1$–$10$ копий/реакция; полезна для подтверждения и валидации.
- Изотермические методы (LAMP, RPA) — быстрая, простая аппаратура, подходит для ПЦР‑незафильтрованных условий и ПЦР‑POC; обычно чуть ниже чувствительность, риск ложноположительных при плохой валидации.
- CRISPR‑базированные детекторы (SHERLOCK, DETECTR) — высокая чувствительность и специфичность, быстрые POC‑варианты, комбинируются с изотермической амплификацией.
- Секвенирование:
- Метагеномное NGS — выявление нового/неизвестного патогена и ковариантов без заранее заданных праймеров; требуется аналитика, время и ресурсы.
- Таргетное/ампликонное NGS — быстрый мониторинг вариантов и эволюции, полезно для эпиднадзора.
- Сэнгер — для верификации отдельных участков/мутаций.
- Мультиплексные ПЦР‑панели и микрочипы — одновременный анализ нескольких патогенов/генов, экономично при дифференциальной диагностике.
Как выбирать метод в условиях эпидемии (алгоритм критериев)
1. Цель: идентификация нового патогена → метагеномное NGS. Массовая диагностика/скрининг → RT‑qPCR сочетание автоматизации. Быстрый ПЦР‑POC/скрининг в полевых условиях → LAMP/CRISPR. Контроль низких загрузок/подтверждение → dPCR. Слежение за вариантами → таргетное/всенгеномное NGS.
2. Скорость и время ответа: экспресс‑методы (LAMP/CRISPR) — <$1$ часа; RT‑qPCR — несколько часов; NGS — от $1$ суток до нескольких дней.
3. Чувствительность/LOD и специфичность: требование клинической чувствительности определяет выбор (qPCR/dPCR предпочтительны).
4. Пропускная способность и ресурсы: массовое тестирование → автоматизированный RT‑qPCR и экстракция; низкие ресурсы/POC → изотермическая/CRISPR.
5. Устойчивость к мутациям: выбирать таргеты в консервативных регионах генома, использовать мультигенные мишени/мультиплекс, регулярно обновлять праймеры по данным NGS.
6. Валидация и регуляция: метод должен пройти аналитическую/клиническую валидацию (LOD, кросс‑реактивность, чувствительность/специфичность), предусмотреть позитивные/негативные/внутренние контроли.
7. Логистика/стоимость: учесть стоимость реактивов, оборудования, обучение персонала и цепочку поставок при масштабировании.
8. Эпидемиологическая ситуация: при низкой распространённости выгодны подтверждающие высокочувствительные тесты и пуллинг; при высокой — быстрый массовый скрининг с последующей избирательной валидацией.
Практическая стратегия при новом патогене
- Шаг 1: метагеномное секвенирование для идентификации и получения референс‑генома.
- Шаг 2: проектирование/валидация RT‑qPCR‑ассей на консервативные участки; параллельно развёртывание быстрых POC‑тестов (LAMP/CRISPR) для первичного скрининга.
- Шаг 3: масштабирование RT‑qPCR с автоматизацией, использование пуллинга при низкой распространённости.
- Шаг 4: постоянный мониторинг генома патогена через NGS и обновление диагностических праймеров/зондов.
- Обязательные меры: контроль качества, регулярная оценка чувствительности/специфичности, алгоритмы подтверждения положительных/пограничных результатов.
Если нужно, могу привести конкретный сравнительный список по чувствительности, времени и стоимости для выбранных методов или шаблон валидации RT‑qPCR.